山新楊PdPapWRKY51基因在脅迫條件下的組織表達(dá)模式

張博超 王佳琳 殷 緣 車易達(dá) 鄧俊杰 張榮沭

（東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150040）

楊樹（Populusspp.）全屬有100多個(gè)品種，具有世界范圍分布廣、生長(zhǎng)迅速、繁殖率高、用途較廣等特點(diǎn)［1～2］。隨著我國(guó)退耕還林政策的實(shí)施，植樹造林工程、天然林保護(hù)工程等事項(xiàng)越來(lái)越受到行業(yè)重視。由于楊樹品種很多，病蟲害的感染程度相對(duì)較大，一旦感染將會(huì)造成嚴(yán)重的損失，并對(duì)生態(tài)環(huán)境形成巨大影響。因此，做好樹木病蟲害的防治工作，對(duì)加快生態(tài)環(huán)境建設(shè)、提高經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值有著重要的意義。

植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了復(fù)雜的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)，轉(zhuǎn)錄因子家族在此過(guò)程中起到重要作用［3～4］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是高等植物體最重要的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在非生物脅迫和生物脅迫防御中起重要作用［5～6］。已有的研究證實(shí)：WRKY基因在染色體上的位置不同，編碼氨基酸的各種理化特性不同，但其七肽氨基酸結(jié)構(gòu)和鋅指結(jié)構(gòu)卻相當(dāng)保守，其N-端含有一個(gè)WRKYGQK 保守序列［7～8］，與DNA 結(jié)合活性相關(guān)；在WRKY 結(jié)構(gòu)域C-端具有一個(gè)典型的鋅指結(jié)構(gòu)，一般由CX4-7CX22-23HXH/C 組成，參與蛋白質(zhì)互作和輔助DNA 結(jié)合的作用［7，9］。研究發(fā)現(xiàn)WRKY基因時(shí)空表達(dá)和植物體脅迫應(yīng)答具有高度一致性，WRKY在根莖葉等組織的差異表達(dá)模式也證明其在植物體脅迫中作為轉(zhuǎn)錄抑制子和轉(zhuǎn)錄促進(jìn)子的不同信號(hào)通路［7～8］。

山新楊（Populus davidiana×P. albavar.Py‐ramidalis）是經(jīng)過(guò)人工雜交選育可以在最低氣溫-39.5℃，年均氣溫2.2℃，無(wú)霜期129 d 的極端環(huán)境下生存的優(yōu)勢(shì)種［2，10］，然而，山新楊WRKY51的生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)模式和生物脅迫應(yīng)答的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)已建立良好的山新楊遺傳轉(zhuǎn)化體系［10～11］。依據(jù)已構(gòu)建的山新楊根部定殖益生菌（木霉菌）和葉片侵染致病菌（鏈格孢菌）的轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，克隆PdPapWRKY51基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)軟件分析。利用RT-qPCR（Real-time Quantitative polymerase chain reaction）技術(shù)揭示PdPapWRKY51在莖尖、葉、莖和根中的表達(dá)模式，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步研究山新楊根部進(jìn)行鹽堿高滲透壓脅迫、處理植物激素、或者接種5種植物土傳病害病原菌48 h 后，PdPapWRKY51的組織表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示此基因的調(diào)控功能和進(jìn)行山新楊基因工程改良育種獲得高抗病新品種提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：山新楊組培苗由本實(shí)驗(yàn)室提供。采用WPM（woody Plant medium）+NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)繼代，采用WPM+IBA 0.4 mg·L-1生根培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。

供試菌株：核盤菌NECC20005（Sclerotinia sclerotiorumNECC20005）、立枯絲核菌CFCC86328（Rhizoctonia solaniCFCC86328）、尖孢鐮刀菌CFCC86068（Fusarium oxysporumCFCC86068）、鏈格孢菌CFCC82114（Alternaria alternateCFCC82114）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)劉志華教授贈(zèng)予［12］；金黃殼囊孢菌C29（Cytospora chrysospermaC29）由東北林業(yè)大學(xué)宋瑞清教授贈(zèng)予。

1.2 方法

1.2.1PdPapWRKY51基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了山新楊與植物益生菌（棘抱木霉）和致病菌（鏈格孢菌）互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（北京，百邁客公司），采用Gang 等［13］的方法進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析。經(jīng)篩選獲得特異表達(dá)基因Potri.007G079800.v3.1（該基因被注釋為PdPapWRKY51）的cDNA 全長(zhǎng)序列。基于此序列信息，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)其全長(zhǎng)引物（見表1），將山新楊葉片材料采用CTAB 裂解法提取總RNA。并用DNaseI（Promega）消化去除DNA。TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以cDNA 為模板，TaKaRa Primer STAR?Max DNA Polymerase 為反應(yīng)試劑，使用表1 中PdPapWRKY51的“PdPapWRKY51-F”和“PdPapWRKY51-R”引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，60℃退火8 s，72℃延伸5 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化并按照說(shuō)明書將其連接到pMD18-T 載體上，送哈爾濱市睿博公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.2PdPapWRKY51基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI 上的ORF Finder 程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析PdPapWRKY51的開放讀框長(zhǎng)度。利用NCBI 的BLASTx 程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行比對(duì)獲得Pd‐PapWRKY51 同源蛋白序列；利用NCBI 的Conserve Domains（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū)。運(yùn)用Psort Ⅱprediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位；利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù) 測(cè)PdPapWRKY51 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；利用ExPASy-ProtParam 工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析編碼蛋白質(zhì)特性。利用DNAMAN9.0 軟件對(duì)PdPapWRKY51同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)PdPapWRKY51蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測(cè)PdPapWRKY51蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。并用Mega6.0 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1000）。

1.2.3PdPapWRKY51基因在組織中的差異表達(dá)量分析

無(wú)菌條件下，將4 周齡生長(zhǎng)在固體WPM 培養(yǎng)基上的山新楊組培苗接入含有12 mL液體WPM培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行生根培養(yǎng)2周。生長(zhǎng)條件為：溫度26℃，濕度80%，16 h/8 h（光/暗）。分別收集組培生根苗頂尖部位（芽、未展開葉及莖；ST）、幼莖（帶有第1和第2完全展開葉片的2個(gè)節(jié)間，S1）、S1上的2 片嫩葉為L(zhǎng)1；莖最下邊2 個(gè)節(jié)間（S3）、S3 上的2 片葉為L(zhǎng)3，莖中部的2 個(gè)節(jié)間為S2、S2 上的2片葉為L(zhǎng)2、根等8 個(gè)部位，將樣品用錫紙分別包好，迅速置于液氮中，然后放入-80℃冰箱中，用于提取總RNA 及分析PdPapWRKY51基因在組織中的差異表達(dá)量。

1.2.4PdPapWRKY51基因在非生物、生物脅迫及激素誘導(dǎo)下組織表達(dá)量分析

無(wú)菌條件下將6周齡山新楊組培苗（不定根長(zhǎng)度在10～20 cm）分別置于含有200 mmol·L-1NaCl、用Na2CO3調(diào)節(jié)pH為10和含有PEG6000（Polyethylene glycol 600）30%（m/v）的液體WPM 培養(yǎng)基中，進(jìn)行鹽、堿和高滲透壓3種非生物脅迫實(shí)驗(yàn)。處理48 h后，分別收集S、L2和R部位樣品。

無(wú)菌條件下將活化后的5 種植物土傳致病真菌接種到PDA 培養(yǎng)基中，在26℃條件下培養(yǎng)10 d獲得大量分生孢子或菌絲體。細(xì)致刮取立枯絲核菌PDA 培養(yǎng)基（1 cm×4 cm×3 塊）上的菌絲溶于WPM 液體培養(yǎng)基中制備菌絲體懸浮液。其他4種真菌用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)計(jì)算分生孢子懸浮液濃度，備用。再將6周齡組培苗的根部分別接種尖孢鐮刀菌、核盤菌、金黃殼囊孢菌和鏈格孢菌分生孢子，使其終濃度為1×105cfu·mL-1。或接種已配制的立枯絲核菌的菌絲體。接種48 h 后，分別收集S、L2和R部位樣品。

無(wú)菌條件下將6 周齡山新楊組培苗分別置于含有100 μmol·L-1ABA（abscisic acid），JA（jasmonic acid）或SA（salicylic acid）的液體WPM 培養(yǎng)基中，處理48 h后，分別收集S、L2和R部位樣品。

上述樣品以非處理組為對(duì)照，分別分析Pd‐PapWRKY51基因在3種非生物脅迫、5種生物脅迫和2 種激素誘導(dǎo)下的組織差異表達(dá)量。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3株苗，每處理3次重復(fù)。

1.2.5 RT-qPCR分析

采用CTAB 法提取收集的山新楊各個(gè)樣品的總RNA，用DNaseI（Promega）消化，去除DNA 污染。以無(wú)污染的RNA 作為模板，使用第一鏈cDAN 反轉(zhuǎn)錄合成酶試劑盒，參照試劑盒（Prime-Script RT，TaKaRa）說(shuō)明書，從2 μg 提取的總RNA中反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。將其用作RT-qPCR模板。使用北京全式金生物公司（TransGen Biotech）的TransStart Top Green qPCR SuperMix 酶和羅氏公司的熒光定量RT-qPCR 儀器（LightCycler 96，Roche）進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。3個(gè)內(nèi)參基因及其GenBank登錄號(hào)分別為PdPapACT2（MN196665）、Pd-PapEF1-α（MN196666）和PdPapTub（MN196667）。所有基因的引物序列見表1。實(shí)時(shí)定量qPCR的反應(yīng)體系為20 μL。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，對(duì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品進(jìn)行了3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃10 min，94℃5 s，59℃15 s 進(jìn)行45 個(gè)循環(huán)，72℃10 s。熔解曲線按照95℃10 s，65℃60 s，97℃1 s進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔCt方法［14］對(duì)PdPapWRKY51基因在無(wú)誘導(dǎo)條件下不同組織部位的組成型表達(dá)和不同誘導(dǎo)條件下不同組織部位的表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，Ct 代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，該方法計(jì)算所得的結(jié)果為PdPapWRKY51基因相對(duì)于3 個(gè)內(nèi)參基因的平均表達(dá)水平的相對(duì)表達(dá)量。使用Microsoft Office Excel 2007軟件包和Minitab 16 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖分析。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組之間的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P＜0.05下比較差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdPapWRKY51基因序列初步分析

PCR 擴(kuò)增山新楊的cDNA，測(cè)序結(jié)果獲得615 bp 的基因片段（見圖1A）。其ORF 序列起始密碼子在第1 個(gè)氨基酸處，終止密碼子位于第204 個(gè)氨基酸處，編碼204 個(gè)氨基酸。WRKY 結(jié)構(gòu)保守域（pfam03106）含有56 個(gè)氨基酸（編碼序列在340～513 bp處）（見圖1B）。

PdPapWRKY51的編碼蛋白的分子式為C982H1487N277O325S11，理論分子量為22.73 kD，理論等電點(diǎn)為6.09，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，不穩(wěn)定指數(shù)為58.83，平均親水性為-0.881，猜測(cè)PdPapWRKY51 蛋白可能是一個(gè)非跨膜親水性的不穩(wěn)定酸性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明其在細(xì)胞核中的分布情況分別占34.8%。由此可以初步推測(cè)PdPapWRKY51在胞內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

2.2 PdPapWRKY51蛋白結(jié)構(gòu)特性分析

對(duì)山新楊PdPapWRKY51 蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，該蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，占64.22%，α-螺旋占9.80%，β-轉(zhuǎn)角占7.35%，延伸鏈占18.63%。

對(duì)PdPapWRKY51 蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示，共比對(duì)上18個(gè)模板，在GMQE值最大條件下，該蛋白與模型2ayd.1 的Identity 較高，為53.42%；coverage 為0.36。此 模 型 為 擬 南 芥At-WRKY1 蛋白C 端的WRKY 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（見圖2B）。

在Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中利用BLASTx 進(jìn)行序列搜索，獲得13 條（來(lái)源于8 個(gè)植物物種）與PdPap‐WRKY51一致性最高的WRKY 基因序列。將Pd-PapWRKY51 與此13 條WRKY 蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示：在N端5條β片層中氨基酸片段β 1（WRKYGKK）和β2（RNYYKCW）的序列是絕對(duì)保守的，以β0（HRVAFRTK）和β3（KKRVER）的保守性略低，而β4（YVITTY）的保守性最低。在不同物種間，N端的七肽氨基酸序列和C端的鋅指結(jié)構(gòu)是最為典型的保守結(jié)構(gòu)域（見圖2A）。C 端的鋅指結(jié)構(gòu)符合C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)的CX4-5CX22-23HXH 序列模式，由此可知PdPapWRKY51及與之具有較高相似度的13 條WRKY蛋白序列均屬于第IIc 類WRKY轉(zhuǎn)錄因子［7～8］。

對(duì)獲得的13 條與PdPapWRKY51 一致性最高的WRKY 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。整個(gè)進(jìn)化樹可劃分為3 大組。第Ⅰ組包括新疆楊（Populus albavar.pyramidalis，Pa）TKR78686.1、胡桃（Juglans regia，Jr）XP_018810763.1、栓 皮 櫧（Quercus suber，Qs）XP_023883657.1、胡桃（Jr）XP_018810764.1、胡楊（P.euphratica，Pe）XP_011021947.1、PdPapWRKY51、毛果楊（P. trichocarpa，Ptr）XP_024456867.1、第Ⅱ組包括榴蓮（Durio zibethinus，Dz）XP_022739823.1、可可樹（Theobroma cacao，Tc）EOX92300.1，第Ⅲ組包含毛果楊（Ptr）XP_024461002.1、胡楊（Pe）XP_011025588.1、毛白楊（P.tomentosa，Pt）ACV92018.1、可 可 樹（Tc）XP_007048143.2、榴 蓮（Dz）XP_022752017.1。PdPapWRKY51 與XP_024456867.1（Ptr）和XP_011021947.1（Pe）的進(jìn)化關(guān)系最近，與XP_007048143.2（Tc）和XP_022752017.1（Dz）進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 山新楊PdPapWRKY51 在頂尖、莖、葉和根組織中的表達(dá)分析

qRT-PCR 分析結(jié)果表明，PdPapWRKY51在山新楊頂尖、莖、葉和根中均有表達(dá)（見圖3）。其在根中的表達(dá)量最高，為頂尖（S）的40.14 倍（P＜0.05）。在葉組織的表達(dá)量為L(zhǎng)2＞L1＞L3，L2 和L1的表達(dá)量分別是L3 的6.93 和2.49 倍。在莖組織的表達(dá)量為J2＞J1＞=J3，J2的表達(dá)量分別是J1和J3的2.51和2.86倍。

2.4 脅迫處理對(duì)PdPapWRKY51 的組織表達(dá)變化分析

2.4.1 非生物脅迫下PdPapWRKY51在頂尖、葉和根中的表達(dá)變化

采用NaCl、Na2CO3和PEG6000 溶液模擬山新楊在鹽、堿或高滲透壓等非生物脅迫條件下Pd‐PapWRKY51的組織差異表達(dá)變化。由圖4 可見，在頂尖部位，PdPapWRKY51表達(dá)量均為顯著上調(diào)（P＜0.05），分別為對(duì)照的7.41、15.23、6.02 倍。在葉組織中，PdPapWRKY51的表達(dá)量?jī)H在堿脅迫組顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），而在鹽脅迫組和高滲透壓脅迫組顯著下調(diào)為對(duì)照組的0.64 倍和0.80 倍（P＜0.05）；在根組織中，3 種脅迫條件下PdPap‐WRKY51表達(dá)量均為下調(diào)，分別為對(duì)照的0.11、0.20、0.55倍（見圖4）。

2.4.2 生物脅迫下PdPapWRKY51在頂尖、葉和根中的表達(dá)變化

山新楊組培苗根部接種5 種植物土傳致病真菌48 h 后，在頂尖部位，受尖孢鐮刀菌（F. oxyspo‐rum；Fo）、核盤菌（S.sclerotiorum；Ss）和細(xì)鏈格孢菌（A.alternata；Aa）對(duì)根部影響，PdPapWRKY51的表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)（P＜0.05），分別上調(diào)表達(dá)10.36、7.06 和2.86 倍（圖5），而受金黃殼囊孢菌（C.chrysosperma：Cc）和立枯絲核菌（R.solani；Rs）的影響不顯著（P＞0.05），分別上調(diào)1.09倍和下調(diào)0.78倍。

在葉組織中，只有根部接種Fo 菌48 h 時(shí)，Pd‐PapWRKY51的表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)（P＜0.05），根 部 接 種Ss、Cc、Aa 和Rs 菌 時(shí)，PdPap‐WRKY51的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著下調(diào)（P＜0.05），分別是對(duì)照的0.10、0.04、0.10和0.06倍。

在根組織中，根部接種Cc和Aa菌48 h時(shí)，Pd‐PapWRKY51的表達(dá)量與對(duì)照相比顯著上調(diào)（P＜0.05），分別是對(duì)照的3.85和1.81倍。根部接種Ss、Fo 和Rs 菌48 h 時(shí)，PdPapWRKY51的表達(dá)量與對(duì)照相比均顯著下調(diào)（P＜0.05），分別是對(duì)照的0.74、0.93和0.02倍（見圖5）。

2.4.3 激素SA、JA和ABA誘導(dǎo)下PdPapWRKY51在頂尖、葉和根中的表達(dá)變化

在3 種植物激素誘導(dǎo)48 h 條件下，山新楊Pd‐PapWRKY51基因的組織表達(dá)量發(fā)生不同的變化。頂尖、葉和根中的PdPapWRKY51基因受SA 誘導(dǎo)均顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05），分別是15.25、3.96 和51.14倍。

受JA 誘導(dǎo)48 h，只有頂尖部位的PdPap‐WRKY51基因表達(dá)量上調(diào)1.87 倍，而葉和根中Pd‐PapWRKY51基因表達(dá)量均顯著下調(diào)至對(duì)照的0.12和0.57倍（P＜0.05）。

而受ABA 誘導(dǎo)48 h，頂尖部位和葉中的Pd‐PapWRKY51基因表達(dá)量上調(diào)1.68 和4.26 倍，葉中的表達(dá)量與對(duì)照相比存在顯著差異（P＜0.05）。根中PdPapWRKY51基因表達(dá)量顯著下調(diào)，為對(duì)照的0.59倍（P＜0.05）（見圖6）。

3 討論

WRKY 是植物細(xì)胞中進(jìn)化比較保守的一類轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與植物對(duì)生物與非生物脅迫應(yīng)答響應(yīng)、激素反應(yīng)、衰老以及生長(zhǎng)發(fā)育等一系列生理活 動(dòng) 并 發(fā) 揮 重 要 的 作 用［3～8，15～16］。盡 管 目 前 對(duì)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的研究很廣泛，但是，有關(guān)WRKY的研究主要集中在擬南芥和水稻等草本模式植物中［15～16］，而在木本植物中研究的相對(duì)較少。因此，在山新楊中克隆WRKY 新基因并研究其組織表達(dá)規(guī)律和在多種逆境脅迫下的調(diào)控規(guī)律非常重要。

本研究克隆到1 個(gè)615 bp 山新楊PdPap‐WRKY51基因。該基因編碼204 個(gè)氨基酸，在N 端含有1 個(gè)保守的WRKY 結(jié)構(gòu)域，同源比對(duì)PdPap-WRKY51 屬于IIc 類WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。生物信息學(xué)分析認(rèn)為PdPapWRKY51為非跨膜親水性蛋白，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核。同源基因進(jìn)化樹分析表明該基因與毛果楊（Ptr）XP_024456867.1 和胡楊（Pe）XP_011021947.1 親緣關(guān)系最近。山新楊PdPap-WRKY51 蛋白含有典型的WRKY 結(jié)構(gòu)域，此保守結(jié)構(gòu)在選擇性與特定的DNA結(jié)合過(guò)程中起主導(dǎo)作用［7～8］。通 過(guò) 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 比 對(duì) 分 析，預(yù) 測(cè)PdPap-WRKY51 和擬南芥AtWRKY1（2ayd.1）蛋白C 端的WRKY 結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)一致性最高（見圖2B），研究認(rèn)為擬南芥AtWRKY1蛋白是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，受SA誘導(dǎo)并部分依賴于NPR1［17～18］。由此推測(cè)Pd-PapWRKY51 基因可能與AtWRKY1 基因的功能有相似之處。

本研究以山新楊6 周齡組培苗為材料研究PdPapWRKY51的空間表達(dá)特性，qRT-PCR 分析表明其在頂尖、葉、莖和根中均有表達(dá)，PdPap‐WRKY51在根中的表達(dá)量最高，是頂尖部位的40.14 倍。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥（A. thaliana）中的At‐WRKY75和大豆（Glycine max）中的GmWRKY13都與植物側(cè)根的生長(zhǎng)有關(guān)［16，19］。Hu 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，小麥（Triticum aestivum）TaWRKY51基因能通過(guò)負(fù)調(diào)控乙烯的生物合成來(lái)促進(jìn)小麥側(cè)根的形成，山新楊PdPapWRKY51基因在根中高度表達(dá)，是否與其側(cè)根的發(fā)育相關(guān)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)遇到干旱、高鹽、極端溫度、營(yíng)養(yǎng)缺乏等各種非生物脅迫。此時(shí)，植物常常通過(guò)調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)非生物逆境的脅迫。本研究發(fā)現(xiàn)山新楊PdPapWRKY51基因在頂尖、葉和根等組織中響應(yīng)多種非生物脅迫上調(diào)了表達(dá)量。受鹽、堿和PEG 脅迫下，頂尖部位PdPapWRKY51均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，受堿脅迫的影響最大，其次是鹽和高滲透壓的脅迫。在葉中，只有堿脅迫使其上調(diào)表達(dá)，鹽和高滲透壓脅迫均使其下調(diào)表達(dá)，且鹽處理使其表達(dá)量下調(diào)更大。在根中，其受脅迫影響程度為鹽＞堿＞PEG。綜合比較發(fā)現(xiàn)，PdPapWRKY51的表達(dá)在3 種非生物脅迫下均有改變，其中受堿的影響更大（見圖4）。有研究認(rèn)為WRKY 轉(zhuǎn)錄因子參與植物對(duì)干旱和鹽脅迫響應(yīng)的過(guò)程并具有多重調(diào)控作用［20］。然而目前對(duì)WRKY51基因在植物應(yīng)對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制的相關(guān)報(bào)道較少，可在未來(lái)深入展開研究。

植物在受到外來(lái)物侵染時(shí)，會(huì)發(fā)生過(guò)敏性反應(yīng)（Hypersensitive Response，HR）。在隨后的一定的時(shí)間內(nèi)，植物會(huì)對(duì)外來(lái)物產(chǎn)生抗性，使植物能夠抵抗細(xì)菌、真菌以及可濾過(guò)性病菌的感染［15］。研究認(rèn)為，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子能夠?qū)Ｒ坏淖R(shí)別NPR1基因啟動(dòng)子中的3 個(gè)W-box［21］，擬南芥中的NPR1 是受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的基因，NPR1 蛋白定位在細(xì)胞核，其過(guò)表達(dá)可以使誘導(dǎo)的PR 基因增加并增強(qiáng)植物的抗病性［22］。本研究發(fā)現(xiàn)5 種土傳植物致病真菌均能使PdPapWRKY51基因的空間表達(dá)發(fā)生改變，在頂尖部位，尖孢鐮刀菌（Fo）、核盤菌（Cc）和細(xì)鏈格孢菌（Aa）使其顯著上調(diào)表達(dá)；在葉中，只有根部接種Fo 時(shí)，其顯著上調(diào)表達(dá)；在根中，接種金黃殼囊孢菌和Aa時(shí)，PdPapWRKY51的表達(dá)量顯著上調(diào)。PdPapWRKY51對(duì)NPR1基因的調(diào)控作用有待于今后繼續(xù)研究。

有報(bào)道認(rèn)為：在擬南芥中，oleic acid（18∶1）濃度的降低可同時(shí)誘發(fā)SA 介導(dǎo)的植物抗病反應(yīng)并抑制JA 介導(dǎo)的植物抗病相關(guān)途徑，使植物抵御營(yíng)活體寄生病原的能力增強(qiáng)，而抵御腐生病原的能力下降。SA 對(duì)JA 信號(hào)途徑的調(diào)控需要WRKY50和WRKY51 蛋白的參與，oleic acid（18∶1）濃度過(guò)低所導(dǎo)致的JA 信號(hào)途徑的抑制也需要WRKY50和WRKY51 蛋白的參與［23］。本研究發(fā)現(xiàn)PdPap‐WRKY51受水楊酸誘導(dǎo)各組織的表達(dá)量均顯著上調(diào)；受茉莉酸和脫落酸誘導(dǎo)頂尖部位的表達(dá)量上調(diào)，根部的表達(dá)量均下調(diào)。因此，PdPapWRKY51對(duì)SA 和JA 介導(dǎo)的植物抗病相關(guān)途徑的調(diào)控機(jī)制有必要進(jìn)行深入研究。總之，本研究驗(yàn)證了Pd‐PapWRKY51響應(yīng)多種脅迫的組織表達(dá)調(diào)控特性，結(jié)果將為進(jìn)一步揭示此基因的功能和通過(guò)分子植物育種構(gòu)建高抗楊樹品種提供依據(jù)。