外源H2S供體NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發特性的影響

劉建新 劉瑞瑞 劉秀麗 賈海燕 卜 婷 李 娜

（甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室/隴東學院生命科學與技術學院，慶陽 745000）

裸燕麥（Avena nudaL.）是起源于中國的一種禾本科（Gramineae）燕麥屬（Avena）一年生雜糧作物，我國主要在內蒙古、河北、山西、陜西和甘肅等地種植，播種面積僅次于小麥（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）和水稻（Oryza sativa）［1］。裸燕麥雖具較強抗逆性，但其籽粒蛋白質和油脂含量高，種子容易劣變［2］。北方地區土壤常含較高鹽堿成分，使鹽堿脅迫成為抑制裸燕麥種子萌發的重要限制因子之一［3］。種子播前預處理是提高作物種子活力的一項重要措施，其中浸種是一種操作簡單、便于實施的有效方法［4］。因此，探尋鹽堿條件下提高種子活力的浸種劑及適宜使用濃度對提高鹽堿地裸燕麥的成苗率具有重要意義。

硫化氫（Hydrogen sulfide，H2S）是植物體中發現的第3種氣體信號分子，它參與植物生長發育和生理代謝過程調控［5］，并能增強植物對鹽脅迫的耐性。如Lai 等［6］發現，用NaHS 預處理能夠阻止Na-Cl 脅迫引起的紫花苜蓿（Medicago sativa）幼苗根部K+的外流，從而保持胞內Na+和K+的穩態。Chen等［7］進一步證明，外源H2S 通過NO 介導的Na+/H+轉運子及H+-ATPase 蛋白和基因表達來保持高鹽脅迫下大麥（Hordeum vulgare）幼苗的Na+、K+平衡。外源H2S 在植物種子萌發及逆境響應過程中也發揮著重要作用。如外源H2S 激活β-淀粉酶活性，促進小麥種子萌發［8］；通過增強活性氧清除，減緩干旱抑制水稻種子萌發［9］；并提高鹽脅迫苜蓿種子萌發抗氧化酶同工酶活性和轉錄物水平［10］；促進NaCl 脅迫下番茄（Lycopersicon esculentum）種子活力提升［11］。然而，用外源H2S 供體NaHS 浸種對鹽堿混合脅迫下作物種子萌發特性影響的研究目前尚未見報道。本研究以裸燕麥種子為試驗材料，模擬其在甘肅種植區土壤的鹽堿組成，研究不同濃度NaHS 浸種處理對不同強度鹽堿混合脅迫下種子萌發特性的影響，探索不同強度鹽堿條件下提高作物種子活力適宜的NaHS浸種濃度，以期為農作物種子播前預處理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和鹽堿溶液配制

供試裸燕麥品種‘定莜9 號’種子由甘肅省定西市農業科學研究院提供。H2S 供體硫氫化鈉（NaHS）購自Sigma-Aldrich 公司，其他化學試劑均為國產分析純。按文獻［12］方法分別配制NaCl、Na2SO4、Na2CO3和NaHCO3原液，模擬甘肅省裸燕麥種植區土壤鹽堿成分，按NaCl∶Na2SO4∶Na2CO3∶NaHCO3摩爾比12∶8∶1∶9配制不同濃度鹽堿混合溶液。

1.2 種子發芽試驗

裸燕麥種子表面消毒后洗凈、晾干，分別用濃度為0、50、100、200 和400 μmol·L-1NaHS 溶液在常溫黑暗條件下浸種8 h，然后用清水沖洗干凈。取培養皿（直徑120 mm）鋪一層濾紙，分別選飽滿健康、大小均一且用不同濃度NaHS 浸種的種子100 粒均勻擺在培養皿中，分別加入濃度為0、15、30、45、60 mmol·L-1鹽堿混合溶液5 mL，置于培養箱中25℃、光/暗（16 h/8 h）交替培養。以胚根突破種皮2 mm 為發芽標準，在種子置床后每12 h 觀察1 次，記錄種子發芽數，每次觀察時補充適量鹽堿溶液，共觀察6 d。發芽6 d后，每皿隨機選取10粒萌發苗用直尺測量胚芽長；將每皿全部發芽苗殺青30 min 后采用稱重法測定幼苗（根、芽）干重，計算每株幼苗干重（SDW）。試驗以每個培養皿為1次重復，共重復3次。

1.3 萌發參數的計算

發芽結束后，根據記錄和測定結果，分別計算種子發芽率、發芽指數、活力指數、平均發芽時間等萌發參數。

式中：Gt為t（d）的種子發芽數，Dt為相應的發芽天數。

式中：S為胚芽長。

式中：Dt為發芽天數，Gt為相應天數的發芽數。

1.4 數據統計分析

為綜合反映NaHS 浸種對鹽堿脅迫下種子萌發的影響，分別計算Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 的隸屬函數值，通過客觀法賦權，計算綜合評價值D［12］。所有數據用SPSS20.0 軟件單因素或雙因素方差分析，其中百分數數據進行反正弦平方根轉換后分析，SSR 法檢驗差異顯著性，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子發芽率的影響

由表1 可知，在不同濃度NaHS 處理下，裸燕麥種子發芽率（Gp）隨鹽堿濃度增大呈顯著下降變化，說明鹽堿混合脅迫顯著抑制裸燕麥種子的發芽率。在0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下，與0 μmol·L-1NaHS 處理（CK）相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理均能一定程度提高Gp，200和400 μmol·L-1NaHS處理的Gp差異不顯著或明顯下降；在45 和60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS 處理的Gp與CK 差異不顯著或使Gp顯著降低。說明50或100 μmol·L-1NaHS 浸種能夠提高30 mmol·L-1以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子的發芽率。

表1 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子發芽率的影響Table 1 Effect of soaking seeds with NaHS on germination percentage of naked oat seeds under salt-alkali stress（%）

2.2 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子發芽指數的影響

表2 顯示，除15 mmol·L-1鹽堿脅迫能顯著提高0 μmol·L-1NaHS 處理的發芽指數（Gi）外，隨鹽堿濃度提高，不同濃度NaHS 處理的Gi均呈顯著下降趨勢。在0～45 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理的Gi與0 μmol·L-1NaHS 處理相比均有一定程度提高，200和400 μmol·L-1NaHS處理的Gi 差異不顯著或顯著下降；在60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS 處理的Gi均低于0 μmol·L-1NaHS處理。

表2 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子發芽指數的影響Table 2 Effect of soaking seeds with NaHS on germination index of naked oat seeds undersalt-alkali stress

2.3 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子活力指數的影響

表3 表明，在不同濃度NaHS 處理下，隨鹽堿濃度提高，裸燕麥活力指數（Vi）呈持續顯著下降趨勢。50和100 μmol·L-1NaHS處理顯著提高了0 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Vi，50 μmol·L-1NaHS 處理使15 和30 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Vi 一定程度提高，而其他濃度NaHS 處理的Vi 顯著下降。說明50 μmol·L-1NaHS 浸種可以提高30 mmol·L-1及以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子的活力指數。

表3 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子活力指數的影響Table 3 Effect of soaking seeds with NaHS on vigor index of naked oat seeds under salt-alkali stress

2.4 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子平均發芽時間的影響

從表4可知，隨鹽堿濃度提高，0和50 μmol·L-1NaHS 處理的平均發芽時間（MGT）無顯著差異，100～400 μmol·L-1NaHS 處理的MGT 呈顯著降低趨勢。在0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下，不同濃度NaHS處理的MGT無顯著差異；在45和60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，50～400 μmol·L-1NaHS處理的MGT低于0 μmol·L-1NaHS 處理。說明NaHS 浸種不會影響30 mmol·L-1及以下濃度鹽堿混合脅迫裸燕麥種子萌發的平均發芽時間，但會縮短45 mmol·L-1以上濃度鹽堿脅迫下的平均發芽時間。

2.5 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥萌發苗單株干重的影響

由表5 可見，隨著鹽堿濃度和NaHS 濃度提高，裸燕麥萌發苗單株干重（SDW）均呈顯著下降趨勢。與0 μmol·L-1NaHS處理相比，除50 μmol·L-1NaHS 處理使0 和15 mmol·L-1鹽堿脅迫下的SDW差異不顯著外，其他濃度NaHS處理均使不同濃度鹽堿脅迫下的裸燕麥萌發苗SDW 顯著下降。說明用50～400 μmol·L-1NaHS 浸種并不能促進裸燕麥萌發苗的生長。

表5 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發苗單株干重的影響Table 5 Effect of soaking seeds with NaHS on dry weight of each plant of naked oat seedlings undersalt-alkali stress（mg）

2.6 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發隸屬函數綜合評價值的影響

不同發芽指標對NaHS 和鹽堿濃度的響應存在差異，為綜合反映裸燕麥種子萌發狀況，采用隸屬函數計算上述發芽指標的綜合評價值（D）。從表6 可知，隨著鹽堿濃度提高，不同濃度NaHS處理的D值均表現為顯著下降變化。與0 μmol·L-1NaHS處理相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 不同程度提高了0～45 mmol·L-1鹽 堿 脅 迫 下 的D 值，200 和400 μmol·L-1NaHS 的D 值差異不顯著或明顯降低；在60 mmol·L-1鹽堿脅迫下，不同濃度NaHS 處理的D值無顯著差異。

表6 NaHS浸種對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發隸屬函數綜合評價值（D）的影響Table 6 Effect of soaking seeds with NaHS on comprehensive evaluation value of membership function（D）for naked oat seed germination under saline-alkali stress

2.7 鹽堿與NaHS 濃度對裸燕麥種子萌發的雙因素方差分析

從表7 可見，鹽堿濃度對Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值的影響極顯著；NaHS 濃度對Gp、Gi、Vi、SDW和D值的影響極顯著，對MGT的影響顯著；鹽堿濃度和NaHS 濃度的交互作用對Gp、Gi、Vi、SDW的影響極顯著，對MGT和D值的影響顯著。

表7 鹽堿濃度和NaHS濃度對裸燕麥種子萌發的雙因素方差分析Table 7 Two-way analysis of variance for salt-alkali and NaHS concentrations on seed germination of naked oat

與CK 相比，15 mmol·L-1鹽堿脅迫除顯著降低Vi 和SDW 外，對Gp、Gi、MGT 和D 值無顯著影響；除30 mmol·L-1鹽堿脅迫的MGT 無顯著變化外，30～60 mmol·L-1鹽堿脅迫的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D 值顯著降低（見表8）。表9 表明，與CK 相比，50 和100 μmol·L-1NaHS 處理下Gp 變化不顯著，Gi、Vi 和D 值升高，MGT 和SDW 下降；200 和400 μmol·L-1NaHS 處理顯著降低了Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D值。

表9 NaHS濃度對裸燕麥種子萌發影響的多重比較Table 9 Multiple comparisons of the effects of NaHS concentration on seed germination of naked oat

3 討論

3.1 鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發的影響

中國大約有1/4 耕地面積的鹽漬化土壤，鹽堿脅迫成為抑制作物種子萌發，從而導致出苗不齊和幼苗生長速率降低的障礙因素［3～4］。裸燕麥這一重要雜糧作物雖然具有耐鹽堿的優良特性［1］，但鹽堿脅迫仍對種子萌發和幼苗生長產生顯著抑制作用，進而造成其產量和品質下降［13］。有研究表明，低鹽（50～100 mmol·L-1）脅迫對燕麥種子萌發［14］、根長和芽長［15］及根數［4］增加有一定促進作用，但較高強度鹽堿脅迫顯著抑制燕麥種子萌發和幼苗生長，表現為隨鹽堿脅迫加劇，種子發芽率、發芽指數和活力指數下降，胚根和胚芽生長減緩［3］，植株干重和葉面積［16］、莖長和莖生物量降低［17］。有關燕麥種子萌發對不同類型鹽堿響應的研究結果顯示，無論是單鹽或復鹽脅迫［18］，還是中性鹽或堿性鹽脅迫［19］，總體上表現為單鹽脅迫對種子萌發的抑制程度大于復鹽脅迫，堿性鹽脅迫的抑制程度大于中性鹽脅迫。本研究進一步表明，鹽堿混合脅迫對裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值有極顯著的影響（見表1～7），隨著鹽堿混合脅迫濃度提高，裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值呈顯著下降趨勢，其中15 mmol·L-1鹽堿脅迫對Gp、Gi、MGT 和D 值的影響不顯著，卻使Vi和SDW 顯著降低（見表8），說明低濃度鹽堿混合脅迫雖不影響種子萌發，而顯著抑制萌發苗的生長；30～60 mmol·L-1鹽堿混合脅迫使裸燕麥種子的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW和D值顯著下降（見表8），表明中高濃度的鹽堿混合脅迫對裸燕麥種子的萌發和幼苗生長產生顯著抑制作用。這與楊科等［20］的鹽堿混合脅迫對不同品種燕麥種子萌發和幼苗生長影響的趨勢基本一致，但程度有所不同。

3.2 外源H2S 對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發特性的影響

利用外源信號物質緩解作物鹽堿脅迫是一種有效方式。目前在緩解燕麥鹽堿脅迫傷害上施用的外源信號物質主要有NO 和H2O2等［21～22］，而利用外源氣體信號H2S 供體NaHS 浸種能否緩解鹽堿脅迫對作物種子萌發抑制的研究迄今鮮見報道。有研究表明，用NaHS 處理能夠減弱NaCl 脅迫對紫花苜蓿種子萌發及幼苗生長的抑制［10］；NaCl 脅迫下兩種耐鹽性不同的番茄種子發芽率、發芽勢、發芽指數和活力指數隨著NaHS 濃度提高呈先升后降趨勢［11］。前人的這些研究以單一中性鹽脅迫為對象，主要針對NaHS 處理濃度對作物種子活力的影響。本研究模擬土壤鹽堿環境，探討了鹽堿混合脅迫下鹽堿濃度和NaHS 浸種濃度交互對裸燕麥種子萌發特性的影響，并采用隸屬函數法綜合評價了外源H2S 對鹽堿脅迫下裸燕麥種子萌發的影響。結果發現，NaHS 濃度及NaHS 濃度和鹽堿濃度的交互作用對Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D值有顯著或極顯著的影響（見表7）。本試驗中，50和100 μmol·L-1NaHS 處理沒有引起Gp 的顯著改變，卻使Gi、Vi 和D 值升高，MGT 和SDW 下降；200和400 μmol·L-1NaHS 處 理 的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值均顯著降低（見表1～6，9）。Gp是最終發芽率高低的體現，Gi 和MGT 反映發芽速率的快慢，Vi 和SDW 與發芽苗的健壯程度相關［14～15］。這說明用50 和100 μmol·L-1NaHS 浸種雖不能提高鹽堿混合脅迫下裸燕麥種子的發芽率和促進萌發苗生長，相反還對幼苗生長有抑制作用，但可加快種子的萌發速率，而200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種則顯著抑制裸燕麥種子的萌發。本試驗結果進一步表明，50 和100 μmol·L-1NaHS 不同程度提高了0～30 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Gp（見表1）和Vi（見表3）及0～45 mmol·L-1鹽堿脅迫下的Gi（見表2）和D 值（見表6），而MGT 和SDW 變化不大或顯著下降（見表4～5）；200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種則降低了不同濃度鹽堿脅迫下的Gp、Gi、Vi、MGT、SDW 和D 值，50～400 μmol·L-1NaHS 浸 種 使60 mmol·L-1鹽堿脅迫下的各發芽指標無顯著變化或明顯下降（見表1～6）。這說明用NaHS浸種能夠緩解鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發的抑制，但緩解作用與鹽堿脅迫強度和NaHS濃度有關。總體來看，50和100 μmol·L-1NaHS 能夠緩解45 mmol·L-1以下濃度鹽堿脅迫對種子萌發的抑制，其中50 μmol·L-1NaHS 的 效 果 好 于100 μmol·L-1，而200 和400 μmol·L-1NaHS 浸種反而會加重鹽堿脅迫對種子萌發的抑制，NaHS 浸種不能緩解60 mmol·L-1鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發的抑制。這與鮑敬等［23］以小麥種子為材料的研究結果基本一致。而外源H2S 促進鹽堿脅迫下作物種子萌發的作用機理尚需進一步探討。

4 結論

外源H2S 供體NaHS 浸種可以提高裸燕麥種子在鹽堿混合脅迫下的萌發能力，且這種作用與NaHS 濃度及鹽堿濃度有關，以50 μmol·L-1NaHS浸種緩解低于45 mmol·L-1鹽堿混合脅迫的效果最佳，NaHS 對60 mmol·L-1鹽堿混合脅迫抑制裸燕麥種子萌發無緩解作用，高濃度（200和400 μmol·L-1）NaHS加重鹽堿脅迫對裸燕麥種子萌發的抑制。