非編碼RNA在神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌中作用的研究進(jìn)展

王 起，武士琪，吳開杰

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061)

前列腺癌是我國男性最常見的惡性腫瘤之一。神經(jīng)內(nèi)分泌前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)是前列腺癌的一種特殊亞型，涵蓋從局灶具有NEPC細(xì)胞的前列腺腺癌(prostatic adenocarcinoma，PAC)到純小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌的一系列表型。正常的前列腺組織主要包含管腔細(xì)胞、基底細(xì)胞和位于基底層的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞(占1%)，參與前列腺上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)、分泌、分化和增殖[1]。原發(fā)性NEPC罕見(約0.5%～2%)，多數(shù)由PAC經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌分化(neuroendocrine differentiation，NED)而來，這被視為前列腺癌的一種適應(yīng)性反應(yīng)或耐藥機(jī)制。在特定條件下，腺癌細(xì)胞發(fā)生NED，通常表現(xiàn)為雄激素受體(androgen receptor,AR)表達(dá)降低，并表達(dá)NED標(biāo)志物如突觸泡蛋白(synaptophysin,SYP)、嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A,CgA)及神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)等，成為NEPC細(xì)胞。雄激素阻斷治療(androgen deprivation therapy，ADT)特別是新型內(nèi)分泌治療，例如恩雜魯胺(enzalutamide，Enz)等，可促進(jìn)NED發(fā)生。此外，缺氧、細(xì)胞因子(例如IL-6)、生長因子、cAMP等均可在體外誘發(fā)NED。

NEPC具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，對(duì)激素治療不敏感，化療效果短暫，多數(shù)患者生存期少于1年，代表著前列腺癌的終末階段。同時(shí)，由于NEPC在病理標(biāo)本的獲取上存在較大困難，通常依賴前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSA)反常的低水平和腫瘤轉(zhuǎn)移特征診斷，診斷效率低。因此，確定NEPC的分子機(jī)制，探索其診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，預(yù)防或延緩其發(fā)展是目前臨床診療的主要需求。近年來大量研究表明，非編碼RNA在細(xì)胞中具有重要的調(diào)控作用，尤其是在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥中扮演了關(guān)鍵的角色[2]。目前，在前列腺癌及NEPC發(fā)生發(fā)展中起調(diào)控作用的研究主要集中在microRNA(miR)、lncRNA及circRNA,本文將圍繞此3種非編碼RNA在NEPC中作用的最新進(jìn)展予以綜述。

1 miR通過多種途徑參與NEPC調(diào)控

1.1 miR簡介miR是一類長度約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，可與mRNA靶標(biāo)的3’端非編碼區(qū)結(jié)合，通過抑制翻譯或降解靶mRNA來阻礙合成基因表達(dá)，抑制蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控中發(fā)揮作用[3]。miR深度參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝等關(guān)鍵細(xì)胞功能[4]。目前，腫瘤miR譜被用來定義相關(guān)的疾病亞型、監(jiān)測患者生存期和治療效果。在前列腺癌中，目前發(fā)現(xiàn)有數(shù)種miR能夠調(diào)節(jié)腫瘤的進(jìn)展、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和轉(zhuǎn)移[5]。在NEPC調(diào)控方面，miR可激活經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌基因，促進(jìn)NED、癌癥轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥。

1.2 miR在NEPC中的調(diào)控作用

1.2.1雙重調(diào)控作用 對(duì)PAC細(xì)胞和體外誘導(dǎo)的NEPC細(xì)胞的微陣列分析顯示NED可造成mRNA和miR表達(dá)的廣泛改變，根據(jù)其調(diào)控靶點(diǎn)的不同，miR可作為致癌因子或抑制因子參與NEPC的生物學(xué)過程[3]。miR在NEPC發(fā)生發(fā)展的不同階段也存在雙重作用。細(xì)胞系和PDX模型中發(fā)現(xiàn)miR-204在PAC階段表現(xiàn)為腫瘤抑制因子，在NEPC中則起致癌作用，調(diào)控癌細(xì)胞生長和集落形成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腺癌細(xì)胞中存在AR/miR-204/XRN1/miR-34a正反饋環(huán)，其在前列腺癌中作用的階段性差異主要依賴AR表達(dá)的改變：PAC階段AR高表達(dá)，雄激素可抑制miR-204表達(dá)從而上調(diào)XRN1，后者則通過靶向miR-34a來上調(diào)AR的表達(dá)，同時(shí)miR-34a還可抑制癌細(xì)胞中CD44的表達(dá)。ADT可導(dǎo)致AR表達(dá)下調(diào)，此時(shí)miR-204高表達(dá)不僅會(huì)通過反饋抑制AR，同時(shí)也可下調(diào)XRN1以促進(jìn)CD44的表達(dá)。CD44的表達(dá)與AR陰性均為NEPC的細(xì)胞特征，說明miR-204可能參與并促進(jìn)ADT誘導(dǎo)的NED[6]。

1.2.2調(diào)控NEPC生物學(xué)改變 在ADT誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞休眠及復(fù)發(fā)的研究中，分別用LTL-313B和LTL-331模型模擬PAC發(fā)展到去勢抵抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC)和NEPC的臨床進(jìn)展過程，并對(duì)這2個(gè)模型在去勢前、去勢后休眠、去勢后復(fù)發(fā)3個(gè)階段的全基因組miR表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-100-5p在ADT壓力環(huán)境中上調(diào)，并參與癌細(xì)胞休眠和NED發(fā)生。在AR-細(xì)胞中，miR-100-5p可以通過下調(diào)pRb信號(hào)通路中的SMARCA5、BAZ2A和THAP2等來刺激快速增殖[4]。此外，通過二代測序發(fā)現(xiàn)miR-652的高表達(dá)也與前列腺癌的高復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。miR-652的過表達(dá)在PC3和LNCaP細(xì)胞系中導(dǎo)致腫瘤生長、遷移、侵襲性增加，在前列腺癌PDX模型中則表現(xiàn)出更高的致瘤性和轉(zhuǎn)移潛能。miR-652直接靶向腫瘤抑制物PP2A的β調(diào)節(jié)亞基PP2R3A，從而激活PI3K/AKT、ERK-1/2和Wnt通路，促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)PC3細(xì)胞EMT和LNCaP細(xì)胞的NED。在過表達(dá)miR-652的PC3細(xì)胞中，間充質(zhì)標(biāo)記物N-鈣黏素增加而上皮標(biāo)記E-鈣黏素減少；而過表達(dá)miR-652的LNCaP細(xì)胞和PDX模型中NE標(biāo)志物明顯增加。EMT和NED在NEPC細(xì)胞中與AR通路抑制同時(shí)發(fā)生[7]，提示miR-652可能通過抑制PP2A功能，激活下游的通路，在PAC階段和NEPC階段發(fā)揮不同的調(diào)控作用，但均促進(jìn)前列腺癌向NEPC進(jìn)展[8]。

1.2.3參與調(diào)控NED的癌基因 擴(kuò)增和抑癌基因的突變或缺失可導(dǎo)致PAC向NEPC進(jìn)展，此前的研究證實(shí)MYCN和AURKA擴(kuò)增、RB1及TP53缺失促使NEPC發(fā)生[9]。p53基因突變可導(dǎo)致前列腺癌細(xì)胞內(nèi)miR-25的表達(dá)上調(diào)，后者可以抑制E3泛素連接酶Fbxw7，從而增加AUKRA的表達(dá)，促進(jìn)小細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌(small cell neuroendocrine carcinoma,SCNC)的增殖和侵襲[10]。N-Myc在前列腺癌中過表達(dá)，YIN等[11]的研究發(fā)現(xiàn)N-myc在PAC階段和CRPC階段通過miR-421/ATM通路發(fā)揮不同作用，在PAC細(xì)胞中N-MYC的過表達(dá)通過上調(diào)miR-421抑制ATM，從而阻止ADT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在CRPC階段miR-421受N-MYC和EZH2作用下調(diào)，其下游ATM表達(dá)增高，引起腫瘤遷移和侵襲性升高，并導(dǎo)致Enz耐藥。免疫與代謝失調(diào)是癌癥發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，針對(duì)前列腺癌細(xì)胞募集肥大細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，浸潤的肥大細(xì)胞能夠靶向AR，一方面上調(diào)IL-8等趨化因子以正反饋促進(jìn)PAC招募肥大細(xì)胞，另一方面升高miR-32在PAC中的表達(dá)，導(dǎo)致PAC細(xì)胞的形態(tài)改變和經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)NEPC發(fā)生。該研究同時(shí)證明Enz對(duì)AR的靶向作用亦可通過AR/IL-8和AR/miR-32通路分別促進(jìn)肥大細(xì)胞募集和NEPC發(fā)生[12]。此外，較早的研究還發(fā)現(xiàn)miR-106b～25簇、miR-663、miR-221等可參與誘導(dǎo)PAC發(fā)生NED[8]。

2 lncRNA參與NEPC的生物學(xué)進(jìn)程

2.1 lncRNA簡介長鏈非編碼RNA(lncRNA)定義為長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，與mRNA相比，lncRNA的表達(dá)水平較低，并具有更顯著的組織特異性[13]。近年來測序技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)著lncRNA的發(fā)現(xiàn)及其功能研究，lncRNA通過轉(zhuǎn)錄過程、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、表觀遺傳學(xué)[14]等機(jī)制在正常生長發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。lncRNA表達(dá)失調(diào)是驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的因素之一，因此被認(rèn)為是具有潛力的癌癥生物標(biāo)志物，在前列腺癌方面，美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)已批準(zhǔn)1種lncRNA-前列腺癌抗原3作為臨床診療中新的診斷標(biāo)志物[13]。lncRNA在NEPC生物學(xué)過程中的角色正在探索中。

2.2 lncRNA的調(diào)控作用

2.2.1表觀遺傳調(diào)控 新型抗雄激素藥Enz等對(duì)治療CRPC有效，但會(huì)促進(jìn)NED的發(fā)生。lncRNA-p21是1種在PAC細(xì)胞系和NEPC細(xì)胞系中差異表達(dá)的lncRNA，通過在Enz/AR/lncRNA-p21/EZH2/STAT3軸中發(fā)揮正向調(diào)控作用，參與Enz誘導(dǎo)的NED。Enz可誘導(dǎo)lncRNA-p21在PAC及NEPC細(xì)胞系中顯著上調(diào)，伴隨神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)升高。EZH2是表觀遺傳效應(yīng)因子PRC2的核心單元，是1種組蛋白-賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，一般通過甲基化H3K2改變下游不同靶基因表達(dá)[7]。lncRNA-p21可與EZH2結(jié)合，同時(shí)抑制EZH2與另一對(duì)PRC2有穩(wěn)定作用的lncRNA-HOTAIR的結(jié)合，從而降低PRC2核心亞基間的相互作用、干擾PRC2形成，并增強(qiáng)EZH2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。實(shí)驗(yàn)證明AKT可磷酸化EZH2并促進(jìn)STAT3甲基化，而lncRNA-p21能夠作為AKT和EZH2的支架促進(jìn)二者相互作用。此外，lncRNA-p21還能夠促進(jìn)EZH2和STAT3相互作用。由此可見lncRNA-p21在該通路上發(fā)揮著多種功能，增強(qiáng)了STAT3的甲基化，誘導(dǎo)了NED發(fā)生[15]。如前所述，HOTAIR能夠與PRC2復(fù)合物相互作用，并參與隨后的生物學(xué)過程，這一功能與癌癥發(fā)展密切相關(guān)，能夠驅(qū)動(dòng)CRPC的發(fā)展[16]。CHANG等[13]的研究認(rèn)為HOTAIR通過多種機(jī)制參與了NED的發(fā)生。HOTAIR是神經(jīng)元限制性沉默元件REST的下游靶向RNA，REST在NEPC中發(fā)揮核心作用。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)HOTAIR在NE表型的CRPC細(xì)胞系中顯著上調(diào)，并與經(jīng)神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)提高同步，敲低HOTAIR基因可導(dǎo)致IL-6誘導(dǎo)的NED被抑制，由此推測HOTAIR參與調(diào)控IL-6誘導(dǎo)的NED過程。此外，對(duì)過表達(dá)HOTAIR的PAC細(xì)胞系和CRPC細(xì)胞系中失調(diào)基因的Go分析識(shí)別出了自噬途徑，且在HOTAIR過表達(dá)的LNCaP細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。自噬在IL-6誘導(dǎo)的NED及NEPC的化療耐藥中具有關(guān)鍵作用[17]，說明HOTAIR可能在自噬途徑上對(duì)NEPC的發(fā)生發(fā)展具有調(diào)控作用。

2.2.2參與AR表達(dá)的調(diào)控 AR表達(dá)的降低是NEPC的經(jīng)典特征，并被認(rèn)為是腺癌細(xì)胞發(fā)生NED的重要因素之一。但部分研究發(fā)現(xiàn)治療誘導(dǎo)性NEPC細(xì)胞中可保留有AR表達(dá)[14,18]，提示表觀調(diào)控可能參與影響NEPC中的AR表達(dá)。lncRNA-LBCS高表達(dá)可恢復(fù)CRPC細(xì)胞對(duì)新型內(nèi)分泌治療藥物(例如比卡魯胺)的敏感性，并與前列腺癌的良好預(yù)后相關(guān)。LBCs在CRPC中顯著下調(diào)，且其表達(dá)與AR表達(dá)及PSA水平呈負(fù)相關(guān)，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)LBCs能夠作為支架與RNA結(jié)合蛋白hnRNPK及AR mRNA相互作用，形成復(fù)合物，以此抑制AR表達(dá)。此外，其他lncRNA如HOTAIR和ARLNC1亦通過不同機(jī)制調(diào)控AR表達(dá)[19]。這些lncRNA對(duì)AR表達(dá)的調(diào)控并未證實(shí)與NEPC中AR的保留或喪失直接相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制研究提示了非編碼RNA參與調(diào)控NEPC中AR表觀調(diào)控的可能性。

2.2.3腫瘤轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后 CREA等[14]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)lncRNA-MIAT在NEPC細(xì)胞系中與SYP同時(shí)高表達(dá)。數(shù)據(jù)庫分析提示MIAT在前列腺癌轉(zhuǎn)移灶中顯著上調(diào)，并與Rb基因突變呈正相關(guān)。該研究認(rèn)為MIAT可以與polycomb蛋白和Rb通路相互作用，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)與MIAT正相關(guān)的基因涉及不良預(yù)后及轉(zhuǎn)移瘤形成，而雄激素依賴基因、胚胎干細(xì)胞沉默基因和HIF1靶基因等則與MIAT負(fù)相關(guān)，表明MIAT的上調(diào)與NEPC的多個(gè)分子生物學(xué)特征相關(guān)。

針對(duì)lncRNA的表達(dá)水平較低的問題，RAMNARINE等[20]運(yùn)用改良的二代測序技術(shù)提高了對(duì)低表達(dá)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的敏感性，并建立了關(guān)于lncRNA的全基因組目錄，將此應(yīng)用于927個(gè)臨床樣本和LTL331模型，在NEPC中識(shí)別出了821種lncRNA，有121種在NEPC中顯著差異，并篩選出表達(dá)量最高幾種lncRNA，包括H19和LINC00617，以及與預(yù)后不良相關(guān)的LINC00514和SSTR5-AS1以及與轉(zhuǎn)移相關(guān)的FENDRR。

3 circRNA是NEPC的潛在調(diào)節(jié)因子

3.1 circRNA簡介circRNA是一類具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，廣泛存在于各種組織和器官中。與線性RNA不同，circRNA的3’端和5’端連接在一起形成閉環(huán)結(jié)構(gòu)，能夠抵抗外切核糖核酸酶的降解，具有高度的穩(wěn)定性和保守性。circRNA在生物體具有多種功能，包括分子海綿作用、順式基因調(diào)控作用、通過競爭關(guān)系調(diào)控線性RNA的生成、參與蛋白質(zhì)的翻譯、作為自噬調(diào)節(jié)劑等[21]。circRNA廣泛參與包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的發(fā)生和發(fā)展，其數(shù)量及功能可影響惡性腫瘤的發(fā)生、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡和血管生成等生物學(xué)過程，測序技術(shù)的更新發(fā)展使其展現(xiàn)出成為各類惡性腫瘤新的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)的潛力。circRNA在NEPC的發(fā)生和進(jìn)展中的作用尚缺乏針對(duì)性的研究證據(jù)，但其對(duì)PAC的調(diào)控功能已有研究支持。

3.2 circRNA調(diào)控前列腺癌的侵襲和遷移circRNA可作為miRNA的分子海綿，通過競爭性結(jié)合miRNA的結(jié)合位點(diǎn)來調(diào)控miRNA的活性[2]，這是circRNA在癌癥發(fā)生發(fā)展中最重要的機(jī)制之一，相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究了該機(jī)制在不同系統(tǒng)腫瘤中的調(diào)控作用。最近的一項(xiàng)研究通過circRNA陣列分析發(fā)現(xiàn)，circABCC4在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，并與患者預(yù)后不良相關(guān)。circABCC4可作為miR-1182的內(nèi)源競爭性RNA，通過分子海綿作用抑制miR-1182的表達(dá)來增加FOXP4的表達(dá)，導(dǎo)致前列腺癌的進(jìn)展[22]。其他類似的研究報(bào)道了circITCH[23]、circMYLK[24]、circFOXO3[25]等多個(gè)circRNA通過對(duì)靶向miRNA的分子海綿作用參與調(diào)控前列腺癌的生物學(xué)過程。此外，circKATNAL1雖然對(duì)miR-145-3p具有分子海綿作用，但其促進(jìn)了miR-145-3p表達(dá)并抑制了下游靶基因表達(dá)[26]，展現(xiàn)了1種新的調(diào)控機(jī)制。值得一提的是，部分circRNA在PC3細(xì)胞系與LNCap細(xì)胞系中存在表達(dá)差異，并與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲相關(guān)。PC3為典型前列腺NEPC細(xì)胞，分化程度低、不含有內(nèi)源性的雄激素受體，常用于CRPC和NEPC的研究。同時(shí)，多種circRNA都在前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移調(diào)控中發(fā)揮作用，而侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能升高是NEPC的顯著特征，這些表現(xiàn)可能提示circRNA在NEPC發(fā)生發(fā)展中具有潛在的生物學(xué)功能。

此外，一項(xiàng)研究識(shí)別了4種AR來源的circRNA-circARs，這些circARs受雄激素抑制，在CRPC中顯著上調(diào)，并在CRPC的Enz耐藥進(jìn)展過程中表達(dá)水平呈上升趨勢[27]，提示circRNA可能參與NEPC的部分生物學(xué)過程，具備成為NEPC生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力。

4 討論與展望

NEPC是前列腺癌致命的終末階段，但由于其AR非敏感性、低PSA表達(dá)、病理組織獲取困難，晚期患者較少行穿刺診斷等原因，NEPC的診斷、監(jiān)測和治療面臨瓶頸。測序技術(shù)的發(fā)展和生物學(xué)研究推進(jìn)了非編碼RNA及其生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)。圖1概括了非編碼RNA從多方面參與對(duì)NEPC發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控。此前也有文章討論了NEPC的生物學(xué)改變、遺傳學(xué)改變、表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及腫瘤微環(huán)境影響[7]，非編碼RNA恰恰廣泛參與到了這些分子生物學(xué)機(jī)制中，調(diào)控NEPC的發(fā)生發(fā)展。對(duì)這些作用機(jī)制的探究有助于推動(dòng)NEPC診療方式的改進(jìn)，并有希望提供新的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)，以提升對(duì)這種高度惡性疾病的應(yīng)對(duì)策略。

圖1 非編碼RNA參與NEPC發(fā)生、發(fā)展的示意圖