miR-411-3p靶向MLK4對膀胱癌細胞增殖及凋亡的影響

曾愛兵，劉 華，馮 霞，許 紅，李小華

(1.洪湖市人民醫院泌尿外科，湖北洪湖 434000；2.湖北理工學院附屬醫院泌尿外科，湖北黃石 435002)

膀胱癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，全世界約300多萬人受其影響[1]。2017年，膀胱癌是全球第5位最常見的癌癥，男女發病率比約為4∶1。雖然膀胱癌的5年生存率是77%，但按照膀胱癌的類型和分期，其生存率明顯下降。如果腫瘤細胞遷移到周圍組織，5年生存率下降至35%；擴散到遠處器官，則降至10%以下[2]。因此，較早發現無近端或遠端轉移的膀胱癌對于提高患者的生存率至關重要。

微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一類長度約為20～25個核苷酸的非編碼RNA[3]。miRNA在所有的生物學過程中都具有重要的作用[4]。miRNA可以在轉錄后RNA水平調控基因表達，且異常的miRNA表達與包括癌癥在內的許多疾病相關[5]。有報道顯示，miR-106在子宮內膜癌中過表達可促進RL95-2細胞增殖，抑制細胞凋亡[6]。還有報道稱，下調表達的miR-124-3p可通過靶向MGAT5促進乳腺癌的增殖和轉移[7]。也有報道表明，miR-506通過抑制孤核受體NR4A1的表達來抑制結直腸癌的發展[8]。miR-411-3p是位于14號染色體上的miRNA[9]，目前對其在腫瘤中作用少有報道。最近，WANG等[10]的研究揭示，長鏈非編碼RNA CDKN2B-AS1通過HIF-1a/VEGF/P38通路與miR-411-3p相互作用，在體內外調控卵巢癌。HALVORSEN等[11]發現，miR-411-3p是與nivolumab治療的非小細胞肺癌患者生存相關的7種miRNA之一。然而，miR-411-3p在膀胱癌細胞中的表達水平和生物學功能鮮有報道。本研究重點探討miR-411-3p對膀胱癌細胞的影響及其潛在的作用靶點，為尋找新的治療膀胱癌的藥物靶點提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源選取洪湖市人民醫院2018年10月至2019年10月期間手術切除的20例膀胱癌組織和癌旁組織作為樣本。所有臨床組織標本均由醫院病理科免疫組化結果確認為癌組織或正常上皮組織。本研究通過洪湖市人民醫院醫學倫理審查會審核，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器5637細胞和人正常膀胱上皮細胞(SV-HUC-1)購于武漢Procell公司；miR-411-3p、MLK4過表達質粒載體購于中國RiboBio公司；pmirGLO載體、雙熒光素報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；10%胎牛血清、DMEM培養基購于美國Gibco公司；羊抗兔IgG-HRP、電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)試劑盒、RNase A、碘化丙啶、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；GAPDH、Ki67、PCNA、Bax、p53、p27、cyclinA購自美國CST公司；Bcl-2、Lipofectamine?2000、Superscript RNase H-逆轉錄酶購自美國Invitrogen公司；MLK4購于英國Abcam公司；RNA purification system購于德國Qiagen公司；DNase-Ⅰ購于瑞士Roche公司；Superscript RNase H-逆轉錄酶和隨機六聚體購于Sigma-Aldrich公司；SYBR Green Master Mix購于美國Thermo Fisher公司；CO2培養箱購于美國Thermo Fisher公司；ABI Prism 7000系統購于美國Applied Biosystems公司。

1.3 細胞培養膀胱癌5637細胞保存于含體積分數為10%的胎牛血清的DMEM培養基中，在37 ℃、體積分數為5%的CO2的濕化培養箱中培養。

1.4 細胞轉染準備5637細胞。miR-411-3p模擬物或pcDNA-MLK4的單獨轉染：使用Lipofectamine? 2000將miR-411-3p模擬物轉染到5637細胞系中，嚴格按照制造商的使用說明進行。轉染48 h后，用實時定量聚合酶反映(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測轉染效率。模擬物和過表達載體的聯合轉染：將mimic+pc-GSKIP與轉染試劑充分混合，25 min后與細胞孵育8 h。48 h后，收集5637細胞。

1.5 RT-qPCR總RNA用RNA purification system提取。用DNase-Ⅰ去除基因組DNA。用Superscript RNase H-逆轉錄酶和隨機六聚體從5 mg總RNA中制備cDNA。對于RT-qPCR，在ABI Prism 7000系統中，使用SYBR Green Master Mix和引物在優化濃度下測定基因表達。miR-411-3p引物序列5’-TAGTAGACCGTATAGCGTACG-3’；MLK4正向引物5’-CTAGTGCCTATGGCGTGGA-3’,反向引物5’-TCCGGCTATCTTACCTTCTCAT-3’；GAPDH正向引物：5’-GGGTGTGAACCACGAGAAAT-3’，反向引物：5’-ACTGTGGTCATGAGCCCTTC-3’。每個基因均生成標準曲線，擴增效率為90%～100%。通過閾值比較，確定基因表達的相對定量。所有結果均以GAPDH為基準進行歸一化。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗Targetscan 7.0推測MLK4和miR-411-3p之間的靶點。將MLK4的3’UTR片段(wt和mut)構建成熒光素酶報告載體(pmirGLO；美國Promega)。此后，細胞分別單獨或聯合miR-181c-5p mimic轉染lucg-GSKIP-wt或Luc-GSKIP-mut。熒光素酶活性由雙熒光素酶報告試劑盒(Promega,USA)測定。

1.7 克隆形成實驗將不同處理組的5637細胞接種于6孔板中，每孔200個細胞，連續接種7 d。廢棄培養基，每個孔用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)仔細洗2次。將菌落在甲醇中固定20 min，然后用吉姆薩(Giemsa)染色液染色。統計≥50個細胞的菌落數，計算菌落形成效率(菌落百分比=菌落形成數/接種細胞數×100%)。

1.8 蛋白質印跡法(Western blot)用BCA法檢測組織中的蛋白。SDS-PAGE電泳法分離蛋白，電轉移至PVDA膜上。用體積分數為5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)阻斷后，用一抗(MLK4、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、p53、p27、cyclinA、GAPDH)在4 ℃孵育過夜。然后將膜與羊抗兔IgG-HRP在室溫下孵育45 min。最后，用ECL試劑盒檢測條帶。信號通過Image LabTM軟件進行分析。

1.9 流式細胞術檢測凋亡在4 ℃下用體積分數為70%的乙醇將膀胱癌5637細胞固定過夜。然后加入10 mg/mL RNase A和碘化丙啶(PI)于4 ℃染色過夜。使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒按照說明書使用流式細胞儀(美國BD公司)檢測細胞凋亡率。Annexin V-FITC(-)/PI(-)為正常細胞，Annexin V-FITC(+)/PI(-)細胞為早期凋亡細胞，Annexin V-FITC(+)/PI(+)為晚期凋亡細胞。Annexin V(-)/PI(+)壞死。所有實驗重復3次，最終結果取平均值。

2 結 果

2.1 miR-411-3p在膀胱癌組織和膀胱癌5637細胞系中低表達通過RT-qPCR檢測了膀胱癌組織和膀胱癌5637細胞系中miR-411-3p的表達。如圖1所示，與對照組比較，膀胱癌組織和5637細胞中的miR-411-3p表達均顯著下調(P<0.05)，說明miR-411-3p在膀胱癌中低表達。

A：在膀胱癌組織及其癌旁組織的表達；B：在人正常膀胱上皮細胞及膀胱癌5637細胞中的表達(*P<0.05)。圖1 miR-411-3p在膀胱癌組織和其細胞系5637中的表達

2.2 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4轉染膀胱癌5637細胞的轉染效率本研究使用miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分別轉染膀胱癌5637細胞。與對照組相比，miR-411-3p mimic組的miR-411-3p水平顯著升高(P<0.05)，而MLK4的mRNA相對表達顯著降低(P<0.05，圖2A、B)；pcDNA-MLK4組的MLK4的mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05，2C、D)。由此可見，miR-411-3p和MLK4過表達成功，且miR-411-3p與MLK4在膀胱癌細胞中呈負向表達。

A：miR-411-3p mimic轉染5637細胞后miR-411-3p的相對表達；B：miR-411-3p mimic轉染5637細胞后MLK4的相對表達；C：pcDNA-MLK4過表達質粒轉染5637細胞后MLK4的mRNA相對表達；D：pcDNA-MLK4過表達質粒轉染5637細胞后MLK4的mRNA相對表達(*P<0.05)。圖2 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分別轉染5637細胞后的表達情況

2.3 miR-411-3p靶向調控MLK4基因我們將miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4聯合轉染膀胱癌5637細胞，進一步考察miR-411-3p和MLK4基因的關系。與對照組比，miR-411-3p mimic組的MLK4 mRNA水平顯著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的MLK4 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的MLK4 mRNA水平顯著回降(P<0.05，圖3)。同樣，我們在蛋白水平也得到了一致的結果。與對照組比，miR-411-3p mimic組的MLK4蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的MLK4蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的MLK4蛋白水平顯著回降(P<0.05，圖3B)。我們通過TargetScan預測miR-411-3p靶向MLK4 3’UTR 2381-2387的位置，進一步通過雙熒光素酶實驗證實miR-411-3p和MLK4基因的關系。如圖3D所示，在Luc-MLK4-wt(野生型)中，與miR-NC組比，miR-411-3p組的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；而在Luc-MLK4-mut(突變型)中，與miR-NC組比，miR-411-3p組的熒光素酶活性無顯著改變(P>0.05，圖3C)。由此可見，在膀胱癌5637細胞中，MLK4是miR-411-3p的靶基因。

A：miR-411-3p和MLK4分別或共轉染5637細胞后MLK4的mRNA相對表達；B：miR-411-3p和MLK4分別或共轉染5637細胞后MLK4的蛋白相對表達；C：TargetScan預測miR-411-3p與MLK4的靶位點；D：雙熒光素酶報告基因實驗驗證靶向關系(與對照組比，*P<0.05；與pcDNA-MLK4組比，#P<0.05)。圖3 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4共轉染5637細胞后miR-411-3p和MLK4的表達

2.4 miR-411-3p通過靶向調控MLK4抑制膀胱癌5637細胞的增殖克隆形成實驗結果表明，與對照相比，miR-411-3p mimic組的克隆形成率顯著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的克隆形成率顯著回降(P<0.05，圖4A、B)。同時，我們還檢測了增殖相關蛋白Ki67和PCNA。Western blot實驗結果表明，與對照相比，miR-411-3p mimic組的Ki67和PCNA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的Ki67和PCNA蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的Ki67和PCNA蛋白水平顯著回降(P<0.05，圖4C)。由此可見，miR-411-3p通過靶向調控抑制了膀胱癌5637細胞增殖。

2.5 miR-411-3p通過靶向調控MLK4促進膀胱癌5637細胞的凋亡流式細胞術結果表明，與對照組相比，miR-411-3p mimic組的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的細胞凋亡率顯著回升(P<0.05，圖5A)。同時，我們還檢測了凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2。Western blot實驗結果表明，與對照相比，miR-411-3p mimic組的Bax/Bcl-2比值顯著升高(P<0.05)，而pcDNA-MLK4組的Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)；與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的Bax/Bcl-2比值顯著回升(P<0.05，圖5B)。由此表明，miR-411-3p通過靶向調控MLK4促進膀胱癌5637細胞凋亡。

A、B：克隆形成實驗，吉姆薩染色(×200)，與對照組比，*P<0.05；與pcDNA-MLK4組比，#P<0.05；C：Ki67和PCNA蛋白的相對表達。圖4 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分別或共轉染5637細胞后的增殖情況

A：流式細胞術檢測凋亡；B：Bax和Bcl-2蛋白的相對表達(與對照組比，*P<0.05；與pcDNA-MLK4組比，#P<0.05)。圖5 miR-411-3p mimic和pcDNA-MLK4分別或共轉染5637細胞后的凋亡情況

2.6 miR-411-3p通過靶向調控MLK4阻礙膀胱癌5637細胞周期進程最后，我們還考察了與細胞周期相關的蛋白：p53、p27和cyclinA。Western blot結果表明，與對照相比，miR-411-3p mimic組的p53和p27蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平顯著降低(P<0.05)；pcDNA-MLK4組的p53和p27蛋白水平顯著降低(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平顯著升高(P<0.05)。與pcDNA-MLK4組比，mimic+MLK4組的p53和p27蛋白水平顯著回升(P<0.05)，而cyclinA蛋白水平顯著回降(P<0.05)。由此可見，miR-411-3p通過靶向調控MLK4阻礙膀胱癌5637細胞周期進程(圖6)。

圖6 Western blot檢測細胞周期相關蛋白的表達

3 討 論

膀胱癌的發病機制復雜，涉及大量基因表達、蛋白功能障礙和多種信號通路。目前，膀胱癌發生的分子遺傳機制尚不清楚。近年來，miRNA在膀胱癌發生發展中的作用和意義越來越受到重視[12-14]。

已有報道稱，miR-411-3p在卵巢癌細胞系中低表達[10]。也有研究指出，lncRNA TTN-AS1在口腔鱗狀細胞癌樣本和細胞中的表達增強，而其作為miR-411-3p的海綿，抑制miR-411-3p的表達[15]。本研究發現，miR-411-3p在膀胱癌組織和膀胱癌5367細胞系中呈現低表達。

混合譜系激酶4(MLK4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于MLK家族[16]。對MLK在腫瘤發生中的作用的認識不斷累積。MLK4已被證明可以抑制MAPK通路(包括p38、JNK和ERK)的激活，負調控MLK3激酶活性，并在卵巢癌中作為細胞侵襲的抑制因子[17-18]。還有研究報道，MLK4上調表達促進乳腺癌細胞的遷移和侵襲[19]。也有報道稱，MLK4的下調表達可通過調節ROS/MAPKs信號通路抑制HCC的轉移并誘導凋亡[16]。XI等[20]揭示，MLK4通過抑制JNK信號通路促進胃癌發生。這些發現強調了MLK4的促腫瘤活性。本研究發現，在膀胱癌5637細胞中，miR-411-3p過表達抑制了MLK4的表達，兩者呈現負相關。進一步證實，miR-411-3p靶向MLK4基因。在5637細胞中，MLK4使增殖相關的Ki67和PCNA表達上調，促進細胞克隆形成。MLK4使凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2表達下調，抑制細胞凋亡。MLK4也使調控染色體復制的cyclinA表達明顯升高；而使阻滯細胞周期的p53和p27表達降低，由此加速細胞周期進程。但miR-411-3p過表達后，靶向MLK4，抑制其表達，抵消了MLK4產生的上述效應。

綜上所述，miR-411-3p可通過靶向MLK4基因，抑制膀胱癌5637細胞增殖并抑制其凋亡，阻滯細胞周期。miR-411-3p對膀胱癌細胞的作用提示可能為尋找治療膀胱癌的潛在新藥提供新的思路。