UPLC-MS/MS同時測定不同產地石仙桃中30種酚類成分的含量

林逸凡，張宗偉，劉劍*，任銘誠，許文，趙海譽，黃鳴清*

(1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700)

石仙桃(PholidotachinensisLindl.)為蘭科石仙桃屬植物石仙桃的假鱗莖或全草，始載于《生草藥性備要》[1]，主要分布于福建、廣東、云南等地。石仙桃具有養陰，清肺，利濕，消瘀的功效，民間常用于治療頭痛、咳嗽、高血壓等，其單方制劑頭痛定糖漿臨床上用于治療神經功能性頭痛、腦震蕩后遺癥[2]。化學研究表明[3-6]，石仙桃中含有黃酮類、菲類、萜類、多糖等組分，但這些研究目前主要集中在多糖、菲類化合物的分離鑒定，很少涉及以黃酮為代表的酚類成分。而大量研究表明[7-14]，石仙桃中黃酮等酚類成分具有局麻、鎮痛、抗氧化、抗驚厥、抗腫瘤、抗疲勞、抗缺氧等多種活性，提示酚類成分可能是其主要藥效物質之一。

在質量評價方面，劉建新等[15]采用紫外可見分光法測定石仙桃總黃酮的含量；張淼等[16]采用高效液相色譜(HPLC)法對不同產地的石仙桃藥材進行指紋圖譜研究；林麗聰等[17]采用HPLC法對石仙桃中的兩個酚類成分(天麻素和天麻苷元)進行含量測定；侯慧靜等[18]采用超高效液相色譜(UPLC)法測定石仙桃中兩個二氫菲類化合物(2,7-二羥基-3,4,6-三甲氧基-9,10-雙氫菲和coelonin)的含量。然而，上述研究僅圍繞總黃酮或個別酚類化合物，并未整體考慮石仙桃中各種酚類成分。此外，石仙桃分布廣泛，在各地區以野生為主，藥材質量參差不齊，有必要對其進行多成分質量控制。因此，本研究建立了一種超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS/MS)同時測定石仙桃中30種酚類成分含量的方法，并對不同產地的石仙桃藥材進行定性定量及聚類分析，將為深入闡明石仙桃藥效物質及質量控制提供實驗依據。

圖1 各成分及內標物化學結構圖

1 材料

Acquity UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Xevo TQ-S三重四極桿質譜(美國Waters公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；JXFSTPRP-24研磨儀(上海凈信科技有限公司)；Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；HH-1恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；KQ-500E臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

乙腈、甲醇、水為質譜純(德國Merck公司)；甲酸為色譜純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其余試劑均為分析純；對照品香草酸(批號：MUST-16062307)、阿魏酸(批號：MUST-16021902)、丁香酸(批號：MUST-17041910)、兒茶素(批號：MUST-16081503)、鞣花酸(批號：MUST-16062603)、葛根素(批號：MUST-15012916)、葒草苷(批號：MUST-13070502)、異葒草苷(批號：MUST-13100902)、牡荊素-2-O-鼠李糖苷(批號：MUST-17101202)、原兒茶醛(批號：MUST-15040502)、咖啡酸(批號：MUST-17032010)、白楊素(批號：MUST-14070310)、根皮素(批號：MUST-15012608)、木犀草素(批號：MUST-17102605)、木犀草苷(批號：MUSE-17030405)、金絲桃苷(批號：MUST-17022010)、洋薊素(批號：MUST-16041015)、夏佛托苷(批號：MUST-14092002)、異夏佛托苷(批號：MUST-14060203)、水仙苷(批號：MUST-17040109)、反式-2-羥基肉桂酸(批號：MUST-16051803)、野黃芩苷(批號：MUST-13091204)均購于成都曼思特生物科技有限公司；牡荊素(批號：111687-200602)、槲皮苷(批號：111538-200504)、蘆丁(批號：100080-201610)、綠原酸(批號：110753-201716)購于中國藥品生物制品檢定所；紫云英苷(批號：13022721)、異綠原酸C(批號：13022523)、山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號：13103022)購于天津仕蘭科技有限公司；芹菜素(批號：Y131214)、沒食子酸乙酯(批號：Y103947)購于北京賽佰草科技有限公司；紫鉚素(批號：T09J7Z17539)購于上海源葉生物科技有限公司；以上對照品均為HPLC級，含量 ≥ 98.00%。

13批石仙桃藥材分別采集于浙江麗水(S1)、福建寧德(S2)、福建泉州(S3)、四川成都(S4)、廣東韶關(S5、S9、S13)、福建漳州(S6、S7)、廣西玉林(S8)、廣西欽州(S10)、廣東揭陽(S11)、云南曲靖(S12)，并經福建中醫藥大學黃澤豪教授鑒定為蘭科石仙桃屬植物石仙桃(PholidotachinensisLindl.)的假鱗莖或全草。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Welch Xtimate UHPLC C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫模式，流動相比例為：0～0.5 min，2% B；0.5～2.5 min，2%→7% B；2.5～4.5 min，7%→13% B；4.5～6.5 min，13%→20% B；6.5～9.5 min，20%→55% B；9.5～12.5 min，55%→90% B；12.5～13.5 min，90% B；13.5～13.6 min，90%→2% B；13.6～15 min，2%→2% B；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進樣量：2 μL。

質譜條件：采用正負切換的多反應監測(MRM)模式，離子源為電噴霧電離源，質譜參數如下：離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣流量800 L·h-1，脫溶劑氣溫度500 ℃，毛細管電壓2.5 kV，脫溶劑氣N2，碰撞氣體Ar，錐孔氣流量50 L·h-1，駐留時間0.02 s。待測成分及內標物的質譜優化參數見表1，各成分MRM色譜圖見圖2。

表1 各化合物及內標物質譜優化參數

圖2 各成分及內標物的MRM色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱定香草酸、阿魏酸、丁香酸、紫鉚素、兒茶素、鞣花酸、葛根素、牡荊素、葒草苷、異葒草苷、牡荊素-2-O-鼠李糖苷、原兒茶醛、咖啡酸、沒食子酸乙酯、白楊素、芹菜素、根皮素、木犀草素、綠原酸、槲皮苷、紫云英苷、木犀草苷、金絲桃苷、異綠原酸C、洋薊素、夏佛托苷、異夏佛托苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁、水仙苷對照品適量，加入純甲醇溶解并稀釋至刻度，制備為濃度2 mg·mL-1的單一對照品儲備液。分別精密量取各對照品儲備液適量，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別得到質量濃度為4 014.78、4 073.7、2 433.2、504、19.76、210、102、4 075.5、2 056.824、2 005.248、10.022 4、1 054.85、509.76、120.4、203.84、2 068、10.128、698.28、200、62.01、408、84、1 833.96、424.2、304.92、247.68、524、1 666.98、783、2 021.376 ng·mL-1的混合對照品溶液。

2.2.2 內標溶液的制備 精密稱定對照品反式-2-羥基肉桂酸、野黃芩苷適量，加入純甲醇溶解并稀釋至刻度，制備為濃度2 mg·mL-1的單一對照品儲備液，分別精密量取內標對照品儲備液適量，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度分別為367.8、836.8 ng·mL-1的內標混合溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 石仙桃全草于60 ℃烤箱中干燥48 h后，粉碎，過篩。精密稱取1 g粉末，置于錐形瓶中，加入40 mL 80%乙醇，搖勻，于80 ℃水浴鍋中回流提取2 h，靜置冷卻，離心(10 000 r·min-1)10 min，取上清液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。用于定量分析的樣品溶液：取續濾液稀釋10倍，按1∶1(200∶200,μL)加入內標溶液后進行測定。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察及定量限測定 精密量取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，用50%甲醇逐級稀釋，并加入內標液，即得一系列不同濃度的標準溶液。以各成分與內標峰面積比值(Y)為縱坐標，待測成分濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸。分別以信噪比為3和10時各對照品溶液的濃度作為檢測限(LOD)和定量限(LOQ)，見表2。

表2 各檢測成分的回歸方程、相關系數、線性范圍、檢測限和定量限

2.3.2 精密度試驗 配制適當濃度的混合對照品溶液，在“2.1”和“2.2”項下的色譜與質譜條件下，當天連續進樣6次測定其日內精密度，連續測定3 d，考察其日間精密度，記錄各對照品與內標的峰面積比，并計算RSD，結果見表3，RSD均小于5.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取石仙桃藥材適量，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，分別于制備后的0、2、4、8、12、24 h進樣測定其峰面積，計算RSD，結果見表3，RSD均小于3.80%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 取同一批石仙桃藥材，按“2.2.3”項下同法制備供試品溶液6份，分別進樣測定，計算其平均含量及RSD，結果見表3，RSD均小于4.12%，表明方法重復性良好。

表3 精密度、重復性、穩定性試驗結果

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的石仙桃藥材適量，平行9份，分別精密加入低、中、高3種濃度的對照品溶液，按“2.2.3”項同法制備供試品溶液，分別進樣測定，計算平均回收率及RSD，結果見表4。

表4 各成分回收率考察結果

2.4 樣品含量測定 分別精密稱取不同產地石仙桃藥材適量，按“2.2.3”項下的方法制備樣品，再按“2.1”和“2.2”項下的LC-MS條件進樣測定，根據內標法計算各批次藥材中30種化合物的含量，結果見表5。

表5 不同產地藥材含量測定結果(μg·g-1,n=3)

2.5 聚類分析 為考察不同產地藥材間的差異性，采用SPSS 26.0軟件，以本法測定的30種化合物含量為變量，以Squared Euclidean Distance為測度，對13批不同產地的石仙桃藥材進行聚類分析，結果顯示(圖3)，13批藥材可聚為2類，其中浙江(S1)、福建(S2、S3、S6、S7)、廣東(S5、S9、S11、S13)、廣西(S8、S10)產地歸為Ⅰ類，四川(S4)與云南(S12)產地歸為Ⅱ類，可見不同地域的石仙桃藥材在質量方面存在一定的差異性。

圖3 13批不同產地石仙桃藥材的層次聚類圖

3 討論

3.1 色譜條件的優化 為快速、有效分離各成分，前期比較了不同規格色譜柱的分離效果。結果顯示，Welch Xtimate UHPLC C18柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)對大部分化合物的分離效率較高，且峰型尖銳，對稱性好，適用于本試驗成分體系的測定。另一方面，通過比較甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液等4種流動相體系的洗脫效果，發現在含甲醇的流動相體系下色譜峰存在嚴重的拖尾與基線漂移現象，且峰型較寬，洗脫能力遠不如含乙腈的流動相體系；而在流動相中加入甲酸，可減少拖尾，改善峰型，促進質子化，增強離子響應，故選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。

3.2 質譜條件的優化 為了使離子響應達到最高，分別采用正、負離子模式對各成分的單一對照品溶液進行檢測，發現多數化合物在負離子模式下響應較高，而個別化合物僅在正離子模式下有響應，因此采用正、負離子切換模式，保證各成分在最佳電離模式下進行測定[19]。此外，對各化合物進行二級質譜掃描，在MRM模式下，通過能量碰撞的方式選擇響應最高的碎片離子作為定量離子(見表1)。以葛根素為例，其一級離子為417.1，經碰撞裂解，產生399.0、351.2、321.1、296.9多個二級離子，其中響應最高且干擾最小的是296.9，即[C18H16O4+]的碎片離子峰，故選其為葛根素的定量離子。

3.3 不同產地藥材含量分析 通過對不同產地藥材進行含量測定，發現各批次間的成分含量存在差異；結合聚類分析可知，沿海產地(浙江、福建、廣東、廣西)藥材質量較一致，但與內陸產地(四川、云南)差異較大。進一步分析發現，內陸產地藥材中的牡荊素、葒草苷、異葒草苷含量較高，且成分總量顯著高于沿海產地藥材。由此推測石仙桃中部分酚類成分含量高低可能與產地地理位置、氣候土壤等因素相關。綜上可見，不同地區的石仙桃藥材在質量上存在較大差異，因此有必要對其進行全面的質量控制研究。

3.4 結論 本試驗基于UPLC-MS/MS建立了一種同時測定石仙桃多成分的定量分析方法，該方法在15 min內實現了對各成分的基本分離，其精密度、重復性及穩定性良好，具有高選擇性、高靈敏度的特點，可用于石仙桃藥材的質量評價。此外，聚類分析結果提示不同地區的石仙桃藥材質量存在較大差異。