基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討紅核婦潔洗液抗炎的活性成分和作用機制

饒鴻宇，李沛波，諶攀，何彥，蘇薇薇

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275)

紅核婦潔洗液是以山楂核為原料，經(jīng)高溫干餾制得的婦科外用洗劑，具有殺蟲止癢、解毒祛濕的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，紅核婦潔洗液對瓊脂致小鼠肉芽腫增生和二甲苯致小鼠耳腫脹均存在良好的抑制作用，具有減輕炎癥反應(yīng)的功效，臨床上主要用于各種原因引起的女性陰道炎[1-2]。本團隊前期研究闡明了紅核洗液的物質(zhì)組成，但對其藥效關(guān)鍵物質(zhì)有待進一步發(fā)掘[3-4]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從醫(yī)學(xué)和化學(xué)等角度系統(tǒng)的探討了藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，并運用計算機預(yù)測藥物的藥理學(xué)模型，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病” 網(wǎng)絡(luò)，揭示藥物的作用機制，為中藥多成分、多靶點和多途徑的復(fù)雜作用機制提供新的研究方向[5-6]。目前已有多個數(shù)據(jù)庫可提供中藥成分和作用靶點等信息，在中藥藥理學(xué)研究和中醫(yī)藥現(xiàn)代化方面發(fā)揮了良好的作用。本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究紅核婦潔洗液抗炎的活性成分和機制，為紅核婦潔洗液的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 化學(xué)成分的收集 本團隊前期基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)對紅核婦潔洗液進行了化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究，共確證和指認了92個化合物，其中酚類化合物26個，醛酮類化合物24個，醇醚類化合物13個，有機酸類及其酯類化合物11個，呋喃及其他含氧雜環(huán)類化合物11個，其他化合物7個，明確了紅核婦潔洗液的化學(xué)組成[3-4]。

1.2 交集靶點的確定及藥材-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)基于結(jié)構(gòu)相似性預(yù)測化合物的靶點，再結(jié)合CTD(https://ctdbase.org/)和TCMSP(http://tcmspw.com/)檢索活性化合物的靶蛋白或靶標基因，借助Drugbank(https://www.drugbank.ca/)和 Uniprot(https://www.uniprot.org/)等數(shù)據(jù)庫查閱靶蛋白對應(yīng)的基因名。以“inflammation”為關(guān)鍵詞在DisGeNET(http://www.disgenet,org/)數(shù)據(jù)庫中搜索炎癥相關(guān)的靶點。將紅核婦潔洗液的藥物成分靶點與DisGeNET數(shù)據(jù)庫中獲得的疾病靶點進行對應(yīng)，獲得交集靶點，并繪制Venn圖。根據(jù)交集靶點結(jié)果，篩選與交集靶點對應(yīng)的功效成分后，運用Cytoscape3.7.2構(gòu)建可視化的藥材-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)，并分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲特征。

1.3 交集靶點功能富集分析和通路富集分析 為進一步解析上述篩選出的靶基因的功能，預(yù)測紅核婦潔洗液的作用機制，將篩選得到的交集靶點導(dǎo)入DAVID v6.7數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)并限定物種為人(Homo sapiens)，進行GO功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的收集及交集靶點的篩選 通過CTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫和靶點預(yù)測共搜集到紅核婦潔洗液成分作用的潛在靶點1 056個，通過DisGeNET數(shù)據(jù)庫查詢現(xiàn)有報道抗炎作用靶點共467個，兩者整合后得到交集靶點143個(見圖1)，視為紅核婦潔洗液抗炎的預(yù)測靶點，通過Cytoscape分析，明確了與預(yù)測靶點相關(guān)的活性成分共84個，其中酚類化合物24個，醛酮類化合物24個，醇醚類化合物11個，有機酸類及其酯類化合物10個，呋喃及其他含氧雜環(huán)類化合物8個，其他化合物7個，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

圖1 紅核婦潔洗液成分潛在靶點與炎癥靶點Venn圖

2.2 交集靶點篩選和藥材-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)分析 利用Cytoscape 建立的藥材-成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)見圖2。由圖2可知，該網(wǎng)絡(luò)共有227個節(jié)點(84個成分，143個交集靶點)，1 392條邊。在143個交集靶點中，Degree值前15的靶點為CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2、ALPL、ALOX5、NOS2、EGFR、CDK5、PTGS2、HSP90AA1、CHRNB2、CHRNA4、NOS3和NAT1。Degree值前5的成分是eugenol(丁香酚)、2-methoxy-4-(1-propenyl)-phenol(異丁香酚)、2-methyl-1H-benzimidazole(2-甲基苯并咪唑)、2-methoxy-phenol(愈創(chuàng)木酚)和coniferyl aldehyde(松柏醛)。

2.3 交集靶點通路分析 運用DAVID平臺的GO富集分析和KEGG通路分析的功能，對紅核婦潔洗液中的143個交集靶點進行研究。通過GO富集分析確定了645個GO條目(P<0.05)。由圖3可知，生物過程相關(guān)的條目有522個(81%)，主要涉及炎癥反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、平滑肌細胞增殖的正向調(diào)控、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、ERK1和ERK2級聯(lián)反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、脂多糖介導(dǎo)的信號通路和免疫應(yīng)答等方面；分子功能相關(guān)的條目有72個(11%)，主要涉及酶結(jié)合、細胞因子活性、蛋白結(jié)合、受體結(jié)合、趨化因子活性、血紅素結(jié)合、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、相同的蛋白結(jié)合、蛋白激酶綁定和類固醇激素受體活性等方面；細胞組成相關(guān)的條目有51個(8%)，主要涉及細胞外空間、細胞表面、細胞外區(qū)域、細胞質(zhì)膜、質(zhì)膜組成部分、質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、細胞膜小窩、細胞基質(zhì)和細胞膜等方面。通過KEGG通路分析共篩選到 107條通路(篩選P<0.05的通路，P值越小，富集程度越高)。圖4為列舉的前25條相關(guān)通路，主要包括腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、NOD樣受體信號通路、Toll樣受體(TLR)信號通路和細胞因子之間的相互作用等。

圖4 紅核婦潔洗液交集靶點KEGG通路富集分析結(jié)果

3 討論

紅核婦潔洗液是以山楂核為原料制成的外用洗液，具有抗炎效果好，毒副作用小的特點，是婦科臨床常見的抗菌消炎藥之一。現(xiàn)階段研究表明紅核婦潔洗液對于多種致病菌具有良好的抑制作用，與臨床效果相一致，然而其抗炎機制方面的研究卻較為少見。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對紅核婦潔洗液中的化學(xué)成分進行研究，系統(tǒng)地分析了紅核婦潔洗液的92個化合物。其中，有72個化合物至少10個以上的靶點相關(guān)，分值從高到低排序的化合物依次為丁香酚、異丁香酚、2-甲基苯并咪唑和愈創(chuàng)木酚等，其中排名最高的是丁香酚，為49個。丁香酚是一種從植物精油中提取得到的酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌和抗腫瘤等多種生物活性，多項研究表明丁香酚可以改善LPS和汽車尾氣等引起的肺損傷，降低IL-6等炎癥因子水平；還可以通過作用于MAPKs和AKT/IκBα信號通路，抑制一氧化氮合酶的表達，降低巨噬細胞的NO水平，發(fā)揮抗炎的功效[7-9]。異丁香酚是丁香酚的異構(gòu)體，Kaur等[10]發(fā)現(xiàn)異丁香酚能抑制COX-2和iNOS的表達，降低PGE2和NO水平，緩解弗氏試劑引起的大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀；還能減弱LPS對小鼠腹膜巨噬細胞的刺激，減少TNF-α的含量，發(fā)揮抗炎作用。Johansson等[11]對麥芽提取物進行研究，發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚具有緩解橄欖油誘發(fā)的小鼠足墊炎癥的功效。Akram等[12]運用細胞模型和動物模型對松柏醛的抗炎活性進行研究，結(jié)果表明松柏醛能抑制JAK2-STAT1-iNOS信號通路，降低NO水平，還能緩解角叉菜膠引起的大鼠足部水腫和佛波醇肉豆蔻酸酯引起的小鼠耳部水腫，具有良好的抗炎功效。由此可見，紅核婦潔洗液中的丁香酚、異丁香酚和愈創(chuàng)木酚等在動物實驗和細胞水平上均表現(xiàn)出良好的抗炎作用。

在“成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖”分析過程中，紅核婦潔洗液預(yù)測的143個靶點中，有55個靶點與至少10個以上的化合物相關(guān)，占38.46%，分值從高到低排序的靶點依次為CYP19A1、PARP1、IDO1、JAK2和ALPL等。CYP19A1是細胞色素P450家族中的一員，具有催化雌激素等類固醇激素生成的作用，多項研究表明LPS刺激引起的炎癥與CYP19A1的表達存在相關(guān)性[13-14]。此外，Qin等[15]發(fā)現(xiàn)CYP19A1的表達與TNF-α的分泌也存在一定的聯(lián)系。IDO1是一種色氨酸分解酶，可以抑制適應(yīng)性T細胞的免疫應(yīng)答，諸多研究表明抑制IDO1的表達可以減輕炎癥反應(yīng)[16-18]。Ho等[19]對IDO1的抗炎機制進行研究，發(fā)現(xiàn)被TNF-α等炎癥因子活化的IDO1可以促進AhR水平的提升，激活巨噬細胞和單核細胞，加重炎癥反應(yīng)。JAK2是酪氨酸蛋白激酶家族中的成員，可激活JAK/STAT通路，在細胞增殖、分化和凋亡等信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。Chen等[20]對蛙皮素刺激的大鼠胰腺細胞進行研究，發(fā)現(xiàn)阻斷JAK2/STAT3信號通路可導(dǎo)致IL-6和TGF-1水平降低，減少細胞死亡。與此同時，多項研究表明JAK2/STAT3信號通路還可以促進巨噬細胞極化，加重炎癥反應(yīng)[21-23]。因此，紅核婦潔洗液可作用于CYP19A1、IDO1和JAK2等靶點，發(fā)揮抗炎的功效。

通過生物功能富集分析和KEGG信號通路分析，發(fā)現(xiàn)紅核婦潔洗液涉及多項生物過程和信號通路，尤其是炎癥反應(yīng)、TNF信號通路和缺氧反應(yīng)等，在抗炎過程中起到重要的作用。TNF是與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的細胞因子家族，活化的TNFR可以促進IL-1、IL-6和IL-10等炎癥因子的釋放，還能激活MAPK-JNK和NF-κB等多條信號通路，活化與機體炎癥相關(guān)的5-脂氧合酶和磷脂酶A2等多個蛋白，加重機體的炎癥反應(yīng)[24]。諸多研究發(fā)現(xiàn)藥物可通過作用于TNF信號通路和LPS信號通路等，下調(diào)IL-1β、IL-6和等TNF-α炎癥因子水平，減輕機體炎癥反應(yīng)，促進康復(fù)[25-26]。HIF-1常在低氧、生長因子和癌基因等因素的刺激下完成活化，也可被活化的Akt激活，維持組織和細胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，使細胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)。活化后的HIF-1α具有增加巨噬細胞遷移抑制因子的分泌，促進巨噬細胞的聚集和侵襲；激活PD-L1等配體，促進B細胞的成熟和T細胞的活化；調(diào)節(jié)細胞因子的表達，促進炎癥性淋巴管中淋巴管再生；促進炎癥條件下樹突狀細胞的成熟的作用[27-28]。有研究發(fā)現(xiàn)藥物可以通過抑制HIF-1途徑，改善缺氧條件和氧化應(yīng)激下誘導(dǎo)的細胞炎癥，改善機體功能[29-30]。因此，紅核婦潔洗液可從減少炎癥因子分泌，改善氧化應(yīng)激和促進免疫功能等方面發(fā)揮加速炎癥的消退，促進患者康復(fù)。

綜上所述，紅核婦潔洗液中的活性成分群可通過多靶點多通路減輕炎癥反應(yīng)，還能調(diào)節(jié)機體免疫功能，改善氧化應(yīng)激和缺氧反應(yīng)，促進患者的康復(fù)。本研究闡明了紅核婦潔洗液抗炎的活性成分及作用機制，為紅核婦潔洗液的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)的依據(jù)。