刃天青微量板法對沙門氏菌的抗菌敏感性試驗

任奕婧 孫嘉笛 孫秀蘭

摘要?采用刃天青微量板法檢測多株沙門氏菌對抗生素的耐藥性，得到最小抑菌濃度（MIC）。通過肉眼觀察和熒光檢測都可判定沙門氏菌的耐藥性，判定時間僅需5?h，刃天青法與微量肉湯稀釋法檢測得到的耐藥性結果一致。其中用顏色觀察能更清晰明確地分辨出耐藥折點，熒光檢測可以動態地反映細菌隨時間變化的生長情況。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏度高的特點，能確定抗生素的耐藥性和精確耐藥MIC值。

關鍵詞?沙門氏菌;藥敏試驗;刃天青微量板法

中圖分類號?R446.5?文獻標識碼?A?文章編號?0517-6611（2021）03-0199-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.053

Abstract?The?resazurin?microplate?method?was?used?to?detect?the?resistance?of?several?Salmonella?strains?to?antibiotics，?and?the?minimum?inhibitory?concentration?（MIC）?was?obtained.The?drug?resistance?of?Salmonella?could?be?determined?by?visual?inspection?and?fluorescence?detection，?and?the?determination?time?was?only?5?hours.?The?drug?resistance?results?obtained?by?the?resazurin?method?and?the?micro?broth?dilution?method?were?consistent.?Among?them，?color?observation?could?more?clearly?distinguish?drugresistant?turning?points，?and?fluorescence?detection?could?dynamically?reflect?the?growth?of?bacteria?over?time.?The?resazurin?microplate?method?was?simple，?fast?and?highly?sensitive.?It?could?determine?antibiotic?resistance?and?precise?resistance?MIC?values.

Key?words?Salmonella;Antibiotic?sensitivity?test;Resazurin?microplate?method

沙門氏菌（Salmonella）作為一種食源性病原體，對人類健康構成了巨大威脅。沙門氏菌可通過受污染的畜禽產品、蛋、奶乃至海洋產品感染人類[1-7]。近年來，由于抗生素的廣泛使用，出現了沙門氏菌耐藥株和多重耐藥株，導致沙門氏菌耐藥性問題日益嚴重，對畜牧業和人類健康都構成了潛在威脅[8-9]。

為了應對這種威脅，迫切需要進行抗生素敏感測試（AST），以快速診斷這些危險細菌的耐藥性，確?？焖?、準確地使用抗生素。當前，各種傳統實驗室方法可用來表征微生物對抗生素的體外敏感性，如常量肉湯稀釋和微量肉湯稀釋法、圓盤擴散法和抗菌梯度法等。但是，這些方法多數都需要冗長的測試程序，通常需要經歷收集樣品、富集培養物，在這之后還至少需要孵育16?h才能進行檢測[10-11]。耐藥細菌的流行率增加表明現在迫切需要能夠在數小時而不是數天之內提供藥敏性數據的AST。除了常規檢測方法，mPCR法和全自動微生物分析儀測定法等新型檢測技術也已運用在耐藥性檢測中[12]。基于已知和賦予細菌抗性基因的擴增和檢測技術，與常規培養方法相比，酶促擴增技術減少了檢測時間[13-14]。但這些技術需要大型且昂貴的儀器，這限制了它們在資源受限的環境中的使用。

刃天青（resazurin）作為一種氧化還原染料，活細菌可以將刃天青轉化為粉紅色的熒光染料試鹵靈（resorufin），繼續反應可以變為白色無熒光的二氫試鹵靈（dihydroresorufin）。因其安全無毒、經濟實惠的優點，已被越來越多地應用于細胞活力和細胞增殖能力的評估[15-16]。以刃天青為指示劑的低成本藥敏試驗方法，能動態地反映細菌的生長情況，可以檢測藥物的作用時間和細菌的耐藥情況。該研究采用刃天青法檢測沙門氏菌對幾種抗生素的敏感性，確定最佳試驗條件，為沙門氏菌的快速、簡便檢測提供一種新方法。

1?材料與方法

1.1?試材

氧氟沙星（Ofloxacin）、環丙沙星（Ciprofloxacin）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）購自美國Sigma試劑有限公司;氨芐西林（Ampicillin）、美羅培南（Meropenem）、四環素（Tetracycline）、刃天青（Resazurin）、鹽酸（HCl）購自上海國藥集團;營養肉湯（NB）、營養瓊脂（NA）購自上海博威生物醫藥有限公司。所有溶液均用超純水制備，所有試劑均為分析純。鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028（Salmonella?typhimurium）為實驗室保存菌株，其余沙門氏菌（Salmonella）分離株均來自華中農業大學，-80?℃保存備用。

1.2?儀器

Lab?Dancer漩渦儀，IKA公司;Spectra?MAX?M5酶標儀，美國Molecular?Devices;WGZ-XT細菌濁度儀，杭州齊威儀器有限公司;平底96孔細菌培養板，南通市海之星實驗器材有限公司;VB-40立式高溫高壓滅菌鍋，德國SYSTEC;BSC-1300超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;SHP-150生化培養箱，上海森信實驗儀器有限公司;EX-OHOUS電子天平，美國奧豪斯公司;Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司。

1.3?細菌培養

取沙門氏菌接種于NB培養基，在37?℃搖床培養，通過細菌濁度儀檢測細菌濃度。將濃度為0.5?MCF的菌液進行梯度稀釋，取100?μL涂布NA瓊脂平板，37?℃培養24?h，進行菌落計數，計算出0.5?MCF菌液對應的細菌培養物的菌落數及菌落形成單位（CFU/mL）。最后用NB將菌液稀釋成所需濃度，4?℃冰箱保存備用。

1.4?微量肉湯稀釋法藥敏試驗

按美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）方案，將倍比稀釋的不同濃度的抗生素分別加到無菌的96孔培養板中，1～11孔加入系列稀釋抗生素100?μL，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。將培養的沙門氏菌菌懸液稀釋至7.5×106?CFU/mL，向每孔中加100?μL，在37?℃恒溫培養箱中孵育[10]。此時，1～11孔藥物濃度分別為128.000、64.000、32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125?μg/mL。20?h后，觀察96孔培養板中的液體渾濁情況，判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。

1.5?刃天青工作條件的優化

用NB肉湯將沙門氏菌進行連續梯度稀釋，分裝96孔培養板中，每孔加入100?μL，終濃度分別為?7.5×106、7.5×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10?CFU/mL，菌液濃度列間遞減;同時每孔加入用NB肉湯稀釋的不同濃度刃天青溶液100?μL，終濃度為1.600、0.800、0.400、0.200、0.100、0.050、0.025?mmol/L，刃天青濃度行間遞減。設無刃天青含菌的NB肉湯為陽性對照，無菌含刃天青的NB肉湯為陰性對照，37?℃恒溫培養箱中培養12?h，每隔1?h觀察顏色變化，檢測熒光值，熒光激發波長為530?nm，發射波長為590?nm，并記錄熒光數據。該試驗測量熒光值和觀察顏色變化來評價藥物的抑菌效果，選用變為粉紅色的時間為試驗所需測試時間，并且將能明顯顯示細菌生長的刃天青濃度選為工作濃度。

1.6?沙門氏菌生長動態觀察

取培養的沙門氏菌，用NB肉湯稀釋成不同濃度7.5×106、7.5?×105、7.5×104、7.5×103、7.5×102、7.5×10?CFU/mL，分裝于96孔板中，100?μL/孔，再每孔加入100?μL的工作濃度刃天青溶液，37?℃恒溫培養10?h，每隔1?h觀察結果并同時檢測熒光值。

1.7?刃天青微量板藥敏試驗

將NB肉湯稀釋的刃天青溶液100?μL加到無菌的96孔培養板中，將抗生素加入第1孔，1～11孔進行梯度稀釋，第12孔不加抗生素作為陽性生長對照。向每孔中加100?μL培養的沙門氏菌菌懸液，在37?℃恒溫培養箱中孵育。選擇對5種抗生素耐藥或敏感的6株沙門氏菌進行藥敏試驗，根據顏色變化及熒光值來判斷沙門氏菌是否生長及其對所試抗生素的敏感性。

1.8?刃天青微量板的應用

將蛋洗凈并浸泡在75%乙醇溶液中后，將蛋清和蛋黃在無菌條件下移入無菌均質袋中，并用均質器打漿2?min以制備懸浮液。通過將25?mL雞蛋混合物添加到175?mL營養肉湯中來制備1∶10樣品稀釋液。用該稀釋液將鼠傷寒沙門氏菌稀釋成7.5×106?CFU/mL，然后按照“1.7”方法進行藥敏試驗。另取樣品100?μL，涂布NA瓊脂平板，37?℃培養24?h觀察是否雜菌污染。

2?結果與分析

2.1?細菌濃度的確定

為了便于細菌定量檢測，用細菌濁度儀測定沙門氏菌濁度，取定量稀釋液涂布NA瓊脂平板，培養24?h后進行菌落計數。經菌落計數，計算出0.5?MCF菌液對應的細菌培養物的菌落數為4.15×108?CFU/mL。

2.2?刃天青工作條件優化

該試驗測試沙門氏菌濃度與刃天青濃度的熒光值和顏色變化，根據其變化來優化測試條件。其中挑選3個時間點來進行結果說明。當培養3?h時，7.5?×106?CFU/mL濃度細菌可使0.025～0.200?mmol/L刃天青變粉紅色。當培養6?h時，細菌濃度≤103?CFU/mL，均不能使所用7種刃天青濃度變色，這顯示沙門氏菌沒有生長;當細菌濃度≥104?CFU/mL，0.025～0.400?mmol/L刃天青可以顯示沙門氏菌生長，≥0.800?mmol/L刃天青的顯色時間相對滯后，其中高濃度細菌（7.5×106?CFU/mL）在全濃度刃天青溶液中都變粉紅色。培養12?h后，只有7.5×10?CFU/mL濃度的細菌在1.600?mmol/L刃天青濃度下不變色，其余濃度的細菌均可使刃天青變為粉色。熒光檢測結果所得趨勢同上。從7.5×105?CFU/mL細菌在不同刃天青濃度下隨孵育時間的熒光檢測結果（圖1）可以看出，細菌與刃天青反應2?h后熒光差異明顯，0.025～0.100?mmol/L刃天青在5?h內還原趨于飽和，0.200～0.800?mmol/L刃天青在5～6?h還原飽和;0.050～0.800?mmol/L刃天青的飽和熒光值接近，說明特定濃度細菌已被刃天青飽和或過飽和。試驗結果表明，低濃度刃天青產生的熒光信號低，反應不靈敏，而過高濃度的刃天青會導致反應時間過長且熒光檢測滯后。綜合顏色變化和熒光值，在5個變色較快的濃度中，0.100?mmol/L刃天青的顯色清晰，熒光值明顯，因此選為刃天青微量板的工作濃度。

2.3?沙門氏菌的生長動態

將不同濃度的沙門氏菌在刃天青微量板上培養12?h，每隔1?h觀察結果。結果顯示（表1），當細菌濃度為7.5×102、7.5×104和7.5×105?CFU/mL時，分別培養8、6和4?h即可見沙門氏菌生長;其中細菌濃度為7.5×10、7.5×103和7.5×106?CFU/mL時，分別在10、7和2?h顯示為部分沙門氏菌生長。由此可見，刃天青微量板進行沙門氏菌藥敏試驗的判斷時間可以控制在5?h。

2.4?刃天青微量板藥敏試驗

用配制好的標準濃度抗生素進行沙門氏菌藥敏試驗，結果顯示（表2），不同沙門氏菌分離株對抗生素氧氟沙星、氨芐西林、環丙沙星、美羅培南、四環素或敏感或耐藥。依據CLSI的最新判斷標準，刃天青微量板與微量肉湯稀釋法藥敏試驗得到的耐藥結果一致。這表明用刃天青微量板法可以在短時間內更為直觀地觀察到耐藥結果。但在檢測沙門氏菌對美羅培南耐藥性時發現，因為所用沙門氏菌對美羅培南均為完全敏感，可以觀察到在耐藥折點有些菌株會有極輕微的變色。

在測量菌株耐藥情況的同時，選擇性地擴大抗生素的濃度范圍，發現用刃天青微量板法得到的MIC值和微量肉湯稀釋法的MIC值會有些許差異，沙門氏菌對環丙沙星和美羅培南的耐藥性如表3所示。擴大濃度范圍后，用2種方法測得的4株菌的MIC有差異。其中3株菌在測量對美羅培南耐藥性時發現，用刃天青微量板法檢測可以得到相對應的MIC值，但用微量肉湯稀釋法檢測得到的卻為敏感，沒有確切的MIC值。這可能是因為刃天青變色敏感，更易被人肉眼和熒光檢測到，而微量肉湯稀釋法只關注培養基的渾濁程度，無法精確得到耐藥值。這間接表明刃天青微量板法比肉湯稀釋法更靈敏，對研究菌株在低濃度抗生素中的生長情況有幫助，有益于在公共衛生方面的用藥安全。

2.5?刃天青微量板的應用

用氧氟沙星、氨芐西林、環丙沙星、美羅培南、四環素5種抗生素對實際樣品進行刃天青微

量板快速藥敏試驗，并同時進行微量肉湯稀釋法藥敏試驗對照，結果顯示（表4），2種藥敏試驗方法的結果具有良好的一致性。

3?結論

該研究以刃天青為檢測物質，對食源性致病菌沙門氏菌的耐藥性進行檢測。所用刃天青微量板法得到的MIC與微量肉湯稀釋法進行判斷的結果具有良好的一致性，且更為靈敏、直觀，在5?h內就可以得出藥敏結果。其中肉眼觀察在實際應用中較為方便，不受試驗設備、場地的制約;熒光檢測可以更清晰地明確耐藥情況，獲得整個耐藥進程，且更為準確、客觀和結果可量化。刃天青微量板法彌補了瓊脂法等常規藥敏試驗方法無法動態檢測細菌生長情況的缺陷，其優勢在于其可清晰辨別耐藥折點，動態地檢測細菌的生長狀況，在低濃度抗生素下可以得到更為精確的耐藥值。刃天青微量板法具有簡便、快速、靈敏、經濟等優點，在檢測各種細菌對抗生素的敏感性中有顯而易見的優勢。同時刃天青法為非特異性檢測，在實際檢測中有更好的應用價值。

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