應用種特異性ITS引物（SS-ITS）鑒別新菠蘿灰粉蚧

徐淼鋒 閆邦奇 管維 廖力 蔡波 李惠萍

摘要?[目的]研究新菠蘿灰粉蚧的種特異性ITS引物，以快速準確鑒定該蟲，可為口岸快速通關提供依據。[方法]采用PCR擴增方法，首次測定分析了11?種粉蚧39?個樣品的新菠蘿灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA?ITS全序列。基于ITS區序列差異設計了針對新菠蘿灰粉蚧的特異性引物，通過篩選引物退火溫度、優化PCR反應條件建立了新菠蘿灰粉蚧的快速分子鑒定方法。[結果]種特異性ITS引物只對新菠蘿灰粉蚧有擴增條帶，能有效擴增出約665?bp的DNA片段，其余種類均未有擴增條帶。靈敏度試驗結果顯示該對引物靈敏度高，其檢測限可達0.1?ng/μL。[結論]采用設計的ITS區種特異性引物可以對新菠蘿灰粉蚧進行快速分子鑒定，該方法可為口岸一線檢測鑒定提供參考。

關鍵詞?新菠蘿灰粉蚧;?分子鑒定;?核糖體DNA

中圖分類號?S41;Q96?文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2021）03-0137-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.03.037

Abstract?[Objective]The?speciesspecific?ITS?primer?for?D.neobrevipes?was?studied?to?rapidly?and?accurately?identify?the?pests，which?can?provide?the?basis?for?the?port?customs?clearance.[Method]The?complete?fragments?of?rDNA?ITS?were?sequenced?by?universal?primer?PCR?amplification?method?for?39?samples?of?eleven?species?including?D.neobrevipes?and?other?mealybugs.Speciesspecific?primer?of?D.neobrevipes?was?designed?based?on?sequences?variation?of?rDNA?ITS?among?the?eleven?mealybugs.A?rapid?molecular?identification?method?for?D.neobrevipes?was?established?by?screening?primer?annealing?temperature?and?optimizing?PCR?reaction?conditions.[Result]?The?ITS?speciesspecific?primers?only?amplified?the?band?of?D.neobrevipes，and?could?effectively?amplify?DNA?fragments?of?about?665?bp.And?the?other?species?did?not?have?amplified?bands.The?sensitivity?test?results?showed?that?the?primer?had?high?sensitivity?and?the?detection?reached?to?0.1?ng/μL.[Conclusion]The?rapid?molecular?identification?for?D.neobrevipes?using?the?ITS?speciesspecific?primers?designed?in?this?paper?is?feasible.This?method?provides?reference?for?the?detection?and?identification?of?the?port.

Key?words?Dysmicoccus?neobrevipes;Molecular?identification;Ribosome?rDNA

新菠蘿灰粉蚧（Dysmicoccus?neobrevipes?Beardsley）隸屬半翅目（Hemiptera）粉蚧科（Pseudococcidae）灰粉蚧屬（Dysmicoccus），為我國禁止進境植物檢疫性有害生物，嚴重危害多種水果和觀賞植物，是具有重要經濟意義的害蟲[1-3]。該蟲與近似種菠蘿灰粉蚧（D.brevipes）在形態特征、寄主植物及分布區域等方面都極為相似。近年來，我國從菲律賓、越南、泰國、印度尼西亞、韓國、柬埔寨、馬來西亞和我國臺灣等地進口的菠蘿、菠蘿蜜、香蕉、龍眼、榴蓮、番荔枝和山竹等寄主上截獲過以上2種粉蚧[4]，據統計在2005—2017年，共截獲3?111?批次新菠蘿灰粉蚧和2?392?批次菠蘿灰粉蚧。目前，新菠蘿灰粉蚧在我國海南和廣東有危害報道，且呈急劇蔓延擴散趨勢[2]。傅遼等[5]根據CLIMEX?3.0與ArcGIS?9.3結合的方法分析了新菠蘿灰粉蚧在我國目前以及未來的潛在地理分布，發現該蟲在我國包括海南、廣東、廣西、云南、福建、臺灣等地高度適生。由于粉蚧蟲體小、體覆蓋白色蠟粉、身體為膜狀結構等特點，其鑒定十分依賴雌成蟲玻片制作的好壞及微觀特征識別，這些往往需要經驗豐富的專業人員才能做到。因此研究該蟲的準確、快速鑒定可有效防止新菠蘿灰粉蚧新的傳入和擴散。

據報道，同一物種的核糖體DNA（rDNA）序列高度保守，無明顯的變異，而種間的rDNA序列具有高度變異性，因此，rDNA常作為昆蟲等生物的分子標記基因用于種類的快速鑒定[6-7]。rDNA由編碼區和非編碼區組成，非編碼區序列種間差異較大，因此，常在18S、5.8S和28S編碼區之間的核糖體內轉錄間隔區的ITS1和ITS2區域設計特異性引物用于種類的快速鑒定。據記載，ITS?區序列被廣泛應用于雙翅目、膜翅目昆蟲種下分類和近緣種鑒別[8-9];?Park等[10]通過分析粉蚧ITS區，設計特異性引物用于區分危害韓國產雪梨上的6?種粉蚧。Beuning等[11]基于分析ITS區差異序列，設計常規PCR引物，可特異區分新西蘭常見的4?種粉蚧。筆者嘗試基于rDNA?ITS序列特征差異設計種特異性引物建立針對新菠蘿灰粉蚧的分子快速檢測方法，為該蟲的快速鑒定提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源?所用材料為2014—2017年珠?？诎都昂？诳诎哆M境水果上截獲的粉蚧樣本，共11?種36?個樣品。所有標本用無水乙醇浸泡并保存于-20?℃冰箱中供試驗用。試驗樣本基本信息見表1。

1.2?DNA提取

粉蚧類昆蟲DNA提取參照廖力等[12]的方法并稍加改進。將單頭供試新鮮蟲樣置于200?μL離心管中（如經乙醇浸泡，需要用0.9%?NaCl溶液洗滌3?h以上），加入60?μL提取液A?（含1%?SDS，50?mmol/L?TrisHCl，25?mmol/L?NaCl，25?mmol/L?EDTA），用研磨棒搗碎樣品，振蕩混勻后于65?℃孵育45?min?（中途混勻2次）;孵化結束后，加入等體積提取液B?[3?mol/L?KAC（pH?7.2）]，緩慢上下顛倒混勻后于冰上放置1?h;取出后，于4?℃、12?000?r/min離心10?min，取上清液移入新的500?μL離心管中，加入2倍體積冷凍無水乙醇，輕輕混勻后置于-20?℃冰箱1?h;取出后，于4?℃、12?000?r/min?離心10?min，小心棄去上清液，加入500?μL?75%乙醇洗滌沉淀，于4?℃、12?000?r/min離心10?min，小心棄去上清液。然后將離心管倒扣于潔凈的濾紙上，自然晾干20?min后，每管加入50?μL?dd?H2O充分溶解，DNA溶液用Nano?Drop?1000微量分光光度計測定核酸質量和濃度，于-20?℃保存備用。

1.3?粉蚧類昆蟲ITS序列PCR擴增及序列測定

粉蚧類昆蟲的ITS全序列PCR擴增通用引物（ITSF/ITSR）參照徐淼鋒等[7]，分別為上游引物ITS?F的堿基序列為5′-AGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，下游引物ITS?R的堿基序列為5′-TATGCTTAAATTCGGCGGGTGA-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。然后，以新菠蘿灰粉蚧、菠蘿灰粉蚧等11種我國口岸常截獲的粉蚧類害蟲成蟲DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為30?μL，每體系分別加入15?μL?2×PCR緩沖液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2?μL?（10?μmol/mL）、Taq?DNA聚合酶0.6?μL?（1.25?U/μL），最后加ddH2O補充至總體積為28?μL，再加2?μL?DNA模板，體系配好后進行PCR擴增。PCR反應條件為94?℃預變性1?min;?35個循環為98?℃?變性10?s、62?℃退火30?s、72?℃延伸30?s;最后72?℃延伸5?min，結束后產物于4?℃冰箱保存。反應試劑購自寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）。

電泳及測序：取5?μL?PCR產物，加1?μL?6×上樣緩沖液（Loading?Buffer），在?1%瓊脂糖凝膠上以90?V電泳?（電泳液為1×TAE）?分離45?min，以BioRad?GelDoc?XR凝膠成像系統分析電泳結果。對經電泳檢測合格的PCR產物進行雙向測序，測序由生工生物工程（上海）股份有限公司和天一輝遠基因科技有限公司協助完成。

1.4?新菠蘿灰粉蚧特異性SS-ITS引物的設計及退火溫度篩選

根據新菠蘿灰粉蚧及其他10?個種類共36?個樣本的ITS測序結果，通過MEGA6.0[13]比對分析序列差異性，采用Primer?primer?6軟件設計新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物1對（ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R），上游引物ITS?Dn260F的堿基序列為5′-CAAGTCGCCGTATCGAGTAC-3′，下游引物ITS?Dn925R的堿基序列為5′-?CGGCGAGGTATCTACTGCT?-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。用新菠蘿灰粉蚧（5025786）基因組DNA為模板，對新菠蘿灰粉蚧種特異性SS-ITS引物進行梯度PCR反應來摸索該對引物的最佳退火溫度，退火溫度范圍上限為平均Tm值高5?℃、下限為平均Tm值低5?℃（ITSDn260F/ITSDn925R其平均Tm值約為58?℃，則退火溫度范圍設定為53～63?℃，篩選出該對引物的最佳退火溫度為60?℃。

1.5?引物的種特異性及靈敏度檢驗

分別以我國口岸進境水果上常見的11?種粉蚧成蟲的DNA為模板，以新菠蘿灰粉蚧為陽性對照，檢驗新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R的種特異性。PCR反應體系為30?μL，每體系分別加入15?μL?2×PCR緩沖液（含dNTP混合液，Mg2+）、上下游引物各1.2?μL?（10?μmol/mL）、Taq?DNA聚合酶0.6?μL（1.25?U/μL），最后加ddH2O補充至總體積為28?μL，再加2?μL?DNA模板，體系配好后進行PCR擴增。反應條件：94?℃預變性1?min;35個循環為98?℃變性10?s;?60?℃退火30?s;72?℃延伸30?s;72?℃延伸5?min;最后于4?℃保存。擴增產物的檢測方法與“1.3”相同。以新菠蘿灰粉蚧成蟲DNA為模板，稀釋6?個10?倍濃度梯度來進行靈敏度檢驗，試驗重復3次。

2?結果與分析

2.1?粉蚧類昆蟲ITS序列PCR擴增?以新菠蘿灰粉蚧、菠蘿灰粉蚧、暗色粉蚧、李比利氏灰粉蚧、南洋臀紋粉蚧、桔臀紋粉蚧、大洋臀紋粉蚧、榕樹粉蚧、柑棲粉蚧、日本臀紋粉蚧和杰克貝爾氏粉蚧等口岸常截獲的11?種粉蚧共36?個樣本的基因組DNA為模板，以通用型引物ITSF/ITSR進行PCR擴增。電泳檢測結果顯示，引物ITSF/ITSR對粉蚧的ITS序列擴增通用性較好，11?種粉蚧均能擴增出一條清晰的目標片段，長度約在1?200?bp（圖1）。將經電泳檢測合格的產物進行雙向測序，結果顯示，以上11?種粉蚧的ITS區PCR產物長度在1?222～1?495?bp。

2.2?新菠蘿灰粉蚧SS-ITS引物的種特異性檢驗

以新菠蘿灰粉蚧及其他10?種粉蚧成蟲的DNA為模板，以設計的種特異性SS-ITS引物（ITS?Dn260F/?ITS?Dn925R）進行PCR擴增，用所建立的PCR檢測體系，對新菠蘿灰粉蚧及其他種類進行種特異性引物檢驗。為確保結果的可靠性，每次試驗均重復3次。電泳結果顯示，該對引物只對新菠蘿灰粉蚧有擴增效果，能擴增出約665?bp的DNA片段（圖2），其余10?個種類均未擴增出條帶，表明該對引物為新菠蘿灰粉蚧的種特異性引物。

2.3?引物的靈敏度驗證

利用微量分光光度計（Nanodrop?1000）測定新菠蘿灰粉蚧（5025786）的DNA濃度為102.3?ng/μL。用所建立的PCR檢測體系，以新菠蘿灰粉蚧DNA模板稀釋5?個10?倍濃度梯度的DNA模板來確定PCR反應的檢測靈敏度，試驗重復3次。結果顯示，模板濃度在1～100?ng/μL時，均能擴增出強烈的檢測信號;對于0.1?ng/μL的DNA模板，檢測擴增產物明顯降低，檢測信號較弱;當DNA模板濃度為0.01?ng/μL時，由于無擴增產物或檢測信號太弱而無法檢出。表明該方法具有較高的靈敏度，其檢測限度為0.1?ng/μL，最適檢測濃度為1～100?ng/μL（圖3）。

3?討論

粉蚧的識別一直以來是一線口岸鑒定的難點。其鑒別主要依據雌成蟲的形態特征，而現場檢疫通常截獲的是卵和若蟲而無法通過形態特征鑒定，即使截獲的是雌成蟲也需要制成玻片標本，其流程是一個繁瑣、耗時的過程。這與進口水果的快速檢疫、快速通關的要求不符。研究表明，通過DNA條形碼技術和分子標記技術可鑒別新菠蘿灰粉蚧。如徐浪等[14-15]采用DNA條形碼技術和線粒體COI基因片段差異特征對進口水果上截獲的新菠蘿灰粉蚧及其近似種進行了鑒別。黃蓬英等[16]應用28S?rDNA基因區段的差異，設計了一種特異性引物用于鑒別新菠蘿灰粉蚧。該研究首次分析了珠?？诎逗秃？诳诎哆M境水果上常截獲的11?種粉蚧36?個樣本的ITS區序列，通過分析新菠蘿灰粉蚧及其他種類ITS區的序列差異，設計了新菠蘿灰粉蚧的種特異性引物，擴增得到的特異性片段長度約為665?bp。該試驗結果表明，該對引物可成功區分新菠蘿灰粉蚧及其他常見種類，靈敏度可高達0.1?ng/μL。

綜上所述，該研究建立的SS-ITS特異性引物快速鑒定新菠蘿灰粉蚧的方法具有快速簡便、特異性高、靈敏度高等優點，最快可在24?h內完成新菠蘿灰粉蚧的鑒定，能夠滿足口岸進境水果快速檢疫、快速通關的要求;對防止該蟲的進一步蔓延擴散具有重要意義。

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