豬鏈球菌的分離鑒定及16S rDNA序列分析

周婷婷，李 媛，任立松，侯 鳳，賀 筍，張 飛

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊830010）

豬鏈球菌病（swineStreptococcosis）是由多種不同菌群的鏈球菌感染引起的一類傳染病的總稱[1]，以敗血癥、淋巴膿腫、心內(nèi)膜炎、多發(fā)性漿膜炎等為典型特征，也可引起人的化膿性腦膜炎、敗血癥、關節(jié)炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱和毒血癥狀，導致器官衰竭而死亡，是一種人畜共患病。該病呈世界范圍內(nèi)分布，美國、俄羅斯、法國、印度、丹麥、荷蘭、加拿大、澳大利亞、新西蘭等國均有報道鏈球菌病的疫情[2-3]，國內(nèi)在20世紀70至80年代后期發(fā)病嚴重，在許多地區(qū)呈地方性流行、大面積暴發(fā)。近些年，河北、江蘇、浙江、四川均發(fā)生人感染豬鏈球菌病例[4-9]。世界動物衛(wèi)生組織將該病列為B類疫病，我國將其列為二類疫病[10]。該病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，并對相關從業(yè)人員的生命安全構成嚴重威脅。

豬鏈球菌（Streptococcous suis，S.suis）根據(jù)莢膜多糖抗原不同分為35個血清型，其中能引起人畜共患的致病性鏈球菌血清型主要為1、2、7、9型。在國內(nèi)發(fā)病豬群中，以2型豬鏈球菌感染報道居多，對9型豬鏈球菌感染報道較少。本試驗對新疆某規(guī)模化豬場病豬的淋巴結、肺臟病料分離株進行分子生物學鑒定，開展藥敏試驗以此選取針對流行菌株的敏感藥物，為明確豬場豬鏈球菌的血清型、研制針對性疫苗及臨床快速診斷等提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

病料采自新疆某豬場臨床發(fā)病豬只淋巴結、肺臟等臟器。

1.2 試驗試劑

胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（胰蛋白胨、大豆蛋白胨、氯化鈉、pH值7.2）由美國BD公司生產(chǎn)；5%綿羊血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制；Taq DNA聚合酶、電泳凝膠回收試劑盒購自OMEGA公司；DNA Marker DL2000、PCR Mix、dNTP、Taq PCR Buffe購自TaKaRa公司；犢牛血清購自杭州四季青有限公司；鏈球菌生化鑒定試劑盒、藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自索萊寶公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 病原菌的分離純化

將病變肺臟、淋巴結組織用火焰灼燒表面做無菌處理后剪取內(nèi)部組織，同時劃線接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆瓊脂平皿與綿羊血液瓊脂平皿中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取呈灰白色、濕潤、邊緣整齊的圓形單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢及純化，選取形態(tài)特征較為統(tǒng)一的優(yōu)勢菌落進行增菌培養(yǎng)。

1.4 生化特性鑒定

取分離純化的細菌純培養(yǎng)物接種于葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、七葉尿素、硫化氫、硝酸鹽、蔗糖、精氨酸等細菌微量生化反應管中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，生化反應根據(jù)鏈球菌生化編碼鑒定手冊（GYZ—12St）判定。

1.5 16S rDNA序列測定及分析

16S rDNA的擴增引物為通用引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，27F：5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3'。按常規(guī)方法提取菌株的基因組DNA作為模板進行PCR擴增，回收PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。使用DNAStar對測序推導得到的16S rDNA序列與GenBank已發(fā)表的國外參考菌株的16S rDNA序列進行同源性比較和遺傳進化的分析，同時采用MegAlign和鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹見表1。

表1 構建系統(tǒng)發(fā)育樹參考菌株Tab.1 Reference strains for constructing phylogenetic trees

1.6 豬鏈球菌的PCR分型檢測

根據(jù)豬鏈球菌不同血清型莢膜多糖cps基因的特異性設計1、2、7、9型豬鏈球菌的分型引物，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具體信息見表2。

以提取的分離菌株基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系：PCR Mix 0.4μL、10×Taq PCR Buffer 5μL、dNTP（2.5 mmol/L）8μL、DNA模板1.5μL、上下游引物各1μL、加ddH2O至終體積50μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃30 s，56℃50 s，72℃90 s，30個循環(huán)；72℃5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 小鼠致病性試驗

將分離菌株接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基37℃過夜培養(yǎng)，腹腔注射法對健康昆明小鼠進行攻擊，攻擊劑量約為5×108CFU/mL，對照組小鼠注射等量生理鹽水，每組10只小鼠，觀察14 d內(nèi)小鼠的死亡情況。及時剖檢死亡小鼠，無菌采集肝臟、肺臟等病變組織并鏡檢。

1.8 藥敏試驗

表2 引物信息Tab.2 Primer information

采用標準K-B紙片擴散法，將培養(yǎng)16～18 h生長良好的100μL分離株菌液均勻涂布于含5%牛血清的胰蛋白大豆瓊脂平皿表面，37℃培養(yǎng)24 h后檢測分離株對林可霉素、多西環(huán)素、青霉素鈉、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林鈉、四環(huán)素、慶大霉素、阿莫西林14種抗生素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征（見圖1）

圖1 分離菌株的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of isolated strains

由圖1可知，該分離菌株在綿羊血液平皿上培養(yǎng)24 h后生長良好，形成灰白色、半透明、邊緣整齊、呈β溶血的光滑型菌落（圖1a）；革蘭氏染色后鏡檢可觀察到革蘭氏陽性、2個到10個不等長鏈短鏈排列的球菌（圖1b）。

2.2 分離菌生化試驗結果（見表3）

由表3可知，該分離株能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖、蔗糖，精氨酸、七葉苷為陽性，甘梨醇、山梨醇、尿素、硫化氫、硝酸鹽、V-P為陰性，符合豬鏈球菌的生化特性。

表3 分離菌生化試驗結果Tab.3 Biochemical test results of isolates

2.3 16S rDNA序列同源性分析（見圖2）

由圖2可知，新疆分離株XJS9與豬鏈球菌標準菌株ATCC 43765（GenBank登錄號：NR_115737.1）同源性為100%。

圖2 分離株XJS9 16S rDNA序列同源性分析Fig.2 Homology analysis of 16S rDNA sequence of isolate XJS9

2.4 16S rDNA序列進化樹（見圖3）

由圖3可知，所比較的源于不同菌株可以分為4個明顯的基因群，分離株與4株豬鏈球菌親緣關系較近，屬于同一個進化分支Ⅰ群。

圖3 分離菌16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene of isolate

2.5 豬鏈球菌的分型鑒定（見圖4）

由圖4可知，以豬鏈球菌的血清型特異性引物進行PCR擴增，結果豬鏈球菌1、2、7型均未擴增出目的條帶，但是豬鏈球菌9型擴增出約390 bp大小的特異性條帶，表明該分離株為9型豬鏈球菌。

圖4 臨床分離菌株9型PCR擴增結果Fig.4 The results of PCR amplification of type 9 clinical isolates

2.6 小鼠致病性試驗

將分離菌株接種于含5%牛血清的胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，腹腔攻擊小鼠24 h后，小鼠表現(xiàn)被毛凌亂、畏冷、食欲廢絕、呼吸急促等癥狀，后期眼內(nèi)出現(xiàn)大量黃白色分泌物。部分小鼠在接種2 d內(nèi)出現(xiàn)死亡。及時剖檢死亡小鼠，脾臟腫大充血、出血，肺臟組織呈現(xiàn)灰白色腫脹。將組織的肺臟、肝臟用生理鹽水研磨稀釋后革蘭氏染色鏡檢結果顯示與豬鏈球菌形態(tài)特征一致。對照組小鼠表現(xiàn)正常。

2.7 藥物敏感性試驗結果（見表4）

表4 藥物敏感性試驗結果Tab.4 Results of drug sensitivity test

由表4可知，該分離菌株對克林霉素、多西環(huán)素、青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林11種藥物敏感，對四環(huán)素、慶大霉素、阿莫西林表現(xiàn)耐藥。

3 討論

豬鏈球菌病是一種世界性分布的人畜共患傳染病[11]。近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)的快速規(guī)模化發(fā)展，豬鏈球菌病已給豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。豬鏈球菌2型是主要的流行血清型。但近年來9型豬鏈球菌的流行呈上升趨勢，在我國各省市均有不同程度的發(fā)生和流行[12-13]。目前，有關新疆地區(qū)9型豬鏈球菌的分子流行情況的資料很少。本試驗結果顯示，新疆地區(qū)分離株與豬鏈球菌標準菌株ATCC43765同源性為100%。16S rDNA的序列信息，如今已經(jīng)廣泛運用于菌種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育學研究[14-15]。根據(jù)不同屬細菌16S rDNA基因同源性為70%～90%，而同一種內(nèi)不同株間基因同源性＞99%[16]，從分子水平確定該菌株為豬鏈球菌，且該株鏈球菌進化穩(wěn)定，未發(fā)生明顯變異。為進一步確定分離株的血清型，設計鑒別豬鏈球菌1、2、7、9型的特異性引物，結果分離株擴增出約390 bp的預期片段，確定為9型豬鏈球菌。

藥敏試驗結果顯示，該分離菌株對克林霉素、多西環(huán)素、青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻呋、氟苯尼考、替米考星、氧氟沙星、磺胺嘧啶鈉、硫酸黏菌素、氨芐西林11種藥物敏感，對四環(huán)素（四環(huán)素類）、慶大霉素（氨基糖苷類）、阿莫西林（β-內(nèi)酰胺類）表現(xiàn)耐藥。Marie等[17]的研究顯示，1996～2000年分離的135株豬源和人源鏈球菌的藥敏結果顯示對β-內(nèi)酰胺類抗生素敏感。張振江等[18]分離1株9型豬鏈球菌，檢測出tetO（四環(huán)素類）、aph-（3）-lia（氨基糖苷類）、SulⅢ（磺胺類）耐藥基因，與該菌株的耐藥譜基本一致。徐引弟等[19]的研究表明，35株2型豬鏈球菌河南分離株中對慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素的耐藥情況嚴重。

目前，豬鏈球菌病是養(yǎng)殖業(yè)發(fā)病率較高的疾病之一，豬體內(nèi)豬鏈球菌的帶菌率約為20%～40%，在條件適宜的情況下細菌會發(fā)生變異產(chǎn)生毒力，誘因為外界溫度的變化、飼料的更換、豬群的數(shù)量變化、豬舍的清潔衛(wèi)生等。發(fā)病后快速傳播，因此加強對豬鏈球菌病的防治，是降低該類疾病發(fā)生和傳播的關鍵途徑之一。本研究藥敏試驗結果提示，加強對養(yǎng)豬場的病原的分離與耐藥情況進行檢測，確定有效的藥物進行治療，獲得最佳治療效果，快速有效的控制豬場病情，但是長時間大量使用抗生會造成豬場細菌耐藥，因此加速疫苗研發(fā)是對抗細菌耐藥的重要性舉措。明確當?shù)亓餍械那v膜血清型，可以為有效防止豬鏈球菌病提供新思路，也為豬鏈球菌疫苗的研發(fā)提供參考。

4 結論

本研究從新疆某豬場病豬組織中分離1株疑似豬鏈球菌，通過細菌的分離鑒定、形態(tài)學觀察、生化試驗等試驗分析，確定該分離株為9型豬鏈球菌，與豬鏈球菌標準菌株ATCC43765同源性為100%。該鏈球菌的分離鑒定為該豬場的豬鏈球菌病的防控提供了參考。