山羊產氣莢膜梭菌的分子流行病學調查與毒素型分析

曹思宇，張彤宇，2，張 燕，成大榮，3*，邢 華，3*

（1．揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州225009；2．南京傳奇生物科技有限公司，江蘇 南京211100；3．江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州225009）

產氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，C.perfringens）又稱魏氏梭菌，在自然界分布廣泛，存在于污水、土壤、人畜糞便及腸道中，是一種人畜共患病原菌[1-2]。產氣莢膜梭菌嚴重影響畜禽的健康養殖，給養殖業造成重大經濟損失，同時也對人類健康造成極大威脅[3-4]。產氣莢膜梭菌是一種專性厭氧的革蘭氏陽性桿菌，可形成芽孢，其能產生多種外毒素和侵襲性酶類，主要有α、β、ε、ι4種致病性毒素[5]。根據致死性毒素及抗毒素中和試驗，將產氣莢膜梭菌分為A、B、C、D、E 5種毒素型[6]。其中，A型攜帶α毒素，主要引起易感動物的壞死性腸炎[7]；B型攜帶α、β、ε毒素，其中β毒素有較強的致死性；C型攜帶α、β毒；D型攜帶α、ε毒素，其中ε毒素是僅次于肉毒毒素和破傷風毒素的梭菌強毒素[8]；E型攜帶α、ι毒素。B型和D型產氣莢膜梭菌感染易引起牛、羊的腸炎或腸毒血癥，E型臨床致病較少。產氣莢膜梭菌可以形成芽孢，能夠穩定長期的存在于易感動物和環境中，對易感動物造成極大的威脅。因此，本試驗采集江蘇地區及揚州大學動物醫院的山羊新鮮糞便進行PCR核酸檢測，對陽性的菌株進行毒素型鑒定，為該地區的山羊產氣莢膜梭菌的分子流行病學的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在江蘇灌云、揚州、宿遷、泰州、連云港等10個地區的肉羊規模養殖場經直腸采集新鮮糞樣1 114份，其中健康糞便樣品971份，發病糞便樣品143份。置于密封袋或滅菌的Ep管，4℃保存。

1.2 樣品處理

取糞球與少量生理鹽水混合后，用接種環蘸取混合物接種于梭菌增菌培養基中培養。采用煮沸法對增菌后的細菌總DNA提取。

1.3 引物合成與反應條件

參考張彤宇[9]的試驗方法合成產氣莢膜梭菌通用引物，反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，55.9℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環；72℃延伸2 min。根據產氣莢膜梭菌的α、β、ε、ι4種毒素基因序列，參照鮑長磊等[10]的試驗方法合成基因分型引物。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物均用1%瓊脂凝膠電泳檢測。

1.4 陽性菌株的分離與鑒定

挑取梭菌檢測呈陽性的增菌培養物，在卵黃CW瓊脂平板（含卡那霉素）上四區劃線分離培養，挑取分離出的可疑菌落接種進行增菌[11]，提取DNA模板，經PCR電泳驗證。同時，挑取可疑菌落經革蘭染色法、亞甲基藍染色法、生化鑒定、牛乳發酵試驗后觀察。

2 結果與分析

2.1 PCR檢測結果（見圖1）

1 114份樣品用梭菌經PCR檢測，213份（19.12%）呈陽性，其中208份（21.42%）來源于健康肉羊，5份（3.50%）來源于發病肉羊。

圖1 產氣莢膜梭菌的PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR amplification of C.perfringens

2.2 產氣莢膜梭菌的分離鑒定與毒素型分析（見圖2）

圖2 分離株的PCR產物電泳圖Fig.2 PCR product electrophoretogram of isolated strain

由圖2可知，對分離鑒定后得到的108株產氣莢膜梭菌用PCR鑒定，A型產氣莢膜梭菌67（62.04%）株、D型產氣莢膜梭菌41（37.96%）株，未見其他型菌株。

2.3 不同地區產氣莢膜梭菌的檢測結果（見表1）

表1 不同地區產氣莢膜梭菌的檢測結果Tab.1 Prevalence of C.perfringens in different regions

由表1可知，各個地區受檢樣品中產氣莢膜梭菌陽性率不等，最高的地區為灌云，其次為揚州。

3 討論

產氣莢膜梭菌可引起多種人獸共患傳染病，臨床癥狀不明顯，易引起死亡，已成為危害人類及養殖業的重要疾病之一。產氣莢膜梭菌所分泌的外毒素是其主要致病因子[12]，多作用于腸道，造成感染動物的急性死亡，其中A型梭菌易引起氣性壞疽和食物中毒[13]；D型梭菌易引起腸毒血癥[14]。另外，不同毒素型對藥物的敏感性不同，應嚴格分型后指導養殖戶正確使用藥物及疫苗，防止疾病發展[15]。

本試驗對臨床糞便樣品進行檢測，結果顯示，產氣莢膜梭菌在江蘇肉羊規模化養殖場流行廣泛，健康羊群普遍攜帶產氣莢膜梭菌，且至少存在2種毒素基因型。從不同地區肉羊產氣莢膜梭菌檢測結果可知，陽性率有所不同，最高的地區為灌云，其次為揚州。對各地區毒素分型鑒定發現，各地區均攜帶A型菌，揚州、泰州和南通除A型以外還攜帶D型菌，可能與規模化養殖場的飼養環境、地理位置有關。

產氣莢膜梭菌是構成動物腸道菌群的一部分，當機體處于健康情時該菌不會引起疾病，但當動物處于亞臨床狀態或爆發壞死性腸炎時，胃腸道的菌群平衡被打破，菌群失調，產氣莢膜梭菌會快速增殖并產生大量毒素，對機體造成損傷。

4 結論

江蘇地區被檢的臨床健康肉羊廣泛攜帶產氣莢膜梭菌，且大多攜帶A型，少部分攜帶D型。為避免疾病的大規模爆發，除注意飼養管理外，需針對菌株的不同毒素型提早預防，并采取相應的控制措施。