新疆維吾爾自治區阿克蘇地區豬源巴氏桿菌的分離鑒定

王 嵐，趙 靜，孫鵬亮，塔·賽日吉瑪，李蓮瑞*

（1．塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾市843300；2．新疆生產建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾843300）

豬巴氏桿菌病是指多殺性巴氏桿菌引起的急性流行性或散發性以及繼發性傳染病，該細菌一般侵襲豬的口腔、鼻咽和上呼吸道[1]。當病原菌大量繁殖導致內源性感染時，可引起豬發生呼吸系統疾病、局灶性感染及敗血癥[2]。近年來，豬群中流行的多殺性巴氏桿菌血清型為A、B和D型[3-4]，主要引發豬肺疫和進行性萎縮性鼻炎等呼吸困難綜合征。巴氏桿菌病原菌常與多種病原混合感染動物機體，從而導致豬群患呼吸道疾病的概率提高，對養豬產業造成極大的經濟損失。通過流行病學調查發現，巴氏桿菌引起的豬呼吸系統疾病在規?；B殖場和散養戶中普遍存在，冬季發病率較高，病豬生長發育受到嚴重影響[5]。本試驗對南疆阿克蘇地區病料進行細菌分離培養，通過菌落形態觀察、16S rRNA基因測序對分離得到的菌株進行鑒定，進而確定引起豬出現呼吸困難癥狀的病原菌的種屬，為該地區由巴氏桿菌引起的豬呼吸系統疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病料樣品采自新疆阿克蘇地區阿克蘇宏盛牧業豬場病死仔豬的心臟、肝、脾、淋巴等。

試驗試劑：1%氫氧化鈉溶液、核酸染料、DNA maker、無菌水、結晶紫溶液、碘溶液、95%乙醇溶液等。

試驗儀器：GHP-9080恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）、HVE-50高壓鍋（平山制作所株式會社）、Eppendorf 5453小型臺式高速離心機（德國艾本德）、Galanz G80F23CN3P-Q5CR0小型微波爐（美的集團）、SW-CJ-2ED潔凈工作臺（賽默飛世爾科技有限公司）、ECLIPSE Ci-L顯微鏡（尼康儀器有限公司）、Thermo sciencific KZ04273/KZ01448/JZ35758微量移液器（德國艾本德）、DK-8D水浴鍋（上海博訊實業有限公司）、ZWY-2102C搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離培養

將采取的病料放入500μL生理鹽水中，制成組織懸液，吸取200μL滴加在LB固體培養基上，置于37℃恒溫培養箱內倒置培養24～48 h。長出菌落后，在瓊脂平板上進行劃線分離純化培養24～48 h，觀察菌落形態。

1.2.2 染色鏡檢

取清潔的載玻片，將25μL無菌生理鹽水滴在載玻片上，取分離純化的單菌落均勻涂于生理鹽水中使其分散，待晾干之后酒精燈外焰固定。細菌涂片革蘭氏染色，結晶紫染色1 min，水洗；碘溶液處理1 min，水洗；95%乙醇脫色30 s，水洗；沙黃復染15 s，水洗。烘干，油鏡下觀察并記錄菌體特征。

1.2.3 基因組DNA的提取

將篩選出來的菌珠接種到含150 mL液體培養基的錐形瓶中，并將其置于搖床中培養過夜。

細菌DNA提取方法按照北京全式金生物技術有限公司DNA提取試劑盒（M10208）說明書操作。

1.2.4 16S rDNA擴增

用通用引物擴增16S rDNA全長序列。

PCR擴增體系：DNA模板1μL、上下游引物各1μL、EasyTaq Super Mix 25μL、加入ddH2O 23μL后共組成50μL體系。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物。

PCR擴增程序：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，72℃再延伸10 min，35個循環。

1.2.5 16S rDNA鑒定巴氏桿菌16S rDNA克隆與pMD-19T載體自連克隆。PCR產物切膠回收按照北京全式金生物技術有限公司膠回收試劑盒（L41118）的說明進行操作。

目的基因與pMD-19T連接反應體系：16S rDNA片段0.5μL、pMD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。pMD-19T載體自連反應體系：ddH2O 0.5μL、pMD-19T Vector 3.5μL、Solution I 6μL。

芽孢桿菌16S rDNA與pMD-19T載體自連轉化。

1.2.6 提取質粒

按照高純度質粒小提試劑盒的說明進行操作。

1.2.7 測序將鑒定后為陽性的質粒送測序（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

1.2.8 序列分析測序所得的序列在NCBI BLAST上進行核苷酸比對，鑒定該細菌的種屬[6]。

2 結果與分析

2.1 分離菌株菌落形態結果（見圖1）

由圖1可知，菌株經48 h培養后，培基上出現光滑、圓形突起、淺白色半透明、邊緣整齊的菌落。用接種環挑取菌落，牽拉成絲。

圖1 分離菌株菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated strains

2.2 分離菌株染色鏡檢結果（見圖2）

由圖2可知，分離菌株細胞呈桿狀、無芽孢、革蘭氏染色陰性。

圖2 分離菌株染色鏡檢（HE 10×100）Fig.2 Staining microscopic examination of isolated strains(HE 10×100)

2.3 16S rDNA電泳結果（見圖3）

由圖3可知，使用通用引物序列擴增出的細菌基因大小約為1 500 bp，與預期大小一致。

圖3 16S rDNA電泳結果Fig.3 Result of 16S rDNA electrophoresis

2.4 16S rDNA克隆質粒鑒定結果（見圖4）

由圖4可知，擴增的基因片段大小約為1 500 bp，與預期的基因片段大小一致，該克隆為陽性克隆。

圖4 16S rDNA克隆質粒的鑒定結果Fig.4 16 s rDNA cloned plasmid of appraisal results

2.5 BLAST分析結果（見圖5）

由圖5可知，該菌株的16S rDNA長度為1 500 bp，將其結果提交到NCBI數據庫進行核酸比較，該菌株為豬源巴氏桿菌。

圖5 16S rDNA測序結果Fig.5 Sequencing result of 16S rDNA

2.6 同源性分析（見圖6、圖7）

由圖6、圖7可知，將其結果提交到NCBI數據庫進行核酸比對，建立進化樹后分析表明，該菌株（PA）與登錄號為AF139584、AY465371、AY465373、NR_026032、AF139577、U66492、KM555273的巴氏桿菌處于同一分支，且根據同源性分析，該菌株與其他巴氏桿菌菌株同源性均為99%以上。根據以上結果可以確定該菌株為巴氏桿菌。

圖6 進化樹分析Fig.6 Evolutionary tree analysis

圖7 同源性比較Fig.7 Homology comparison

3 討論

巴氏桿菌病是養豬業中一種重要的傳染性疾病。一般情況下，動物在發病前體內已經存在致病菌，當畜禽機體抵抗力下降時，致病菌便乘虛侵入體內，引發內源性感染最終導致死亡。巴氏桿菌常與多種病原發生混合感染，在氣候變化劇烈等多種因素的共同作用下，豬群抵抗力降低，病原菌在其體內大量繁殖，進而導致繼發性感染[7]。豬群發病后難以治療并且治療后容易復發，造成仔豬大量死亡。

近年來，由細菌感染引起動物發病的病例越來越多，給養殖業造成巨大損失[8]。目前，疫苗免疫仍是預防巴氏桿菌病的重要措施之一[9]，因此，在日常養殖中，根據自身養殖場的實際情況，制定科學的疾病防控措施，始終以預防為主，防重于治的思維進行科學化養殖；同時，養殖戶應每年對豬巴氏桿菌疾病預防性的接種兩次，可有效預防或減少該病的流行，避免給養殖者帶來經濟損失。

本研究通過從病料中分離到的一株細菌，根據菌落培養和染色鏡檢的特點，初步鑒定該菌株為革蘭氏陰性菌。采用分子生物學方法對菌株進行鑒定，并用16S rDNA通用引物對16S rDNA基因進行擴增和序列測定，結果表明，該菌株為巴氏桿菌，說明新疆阿克蘇地區存在巴氏桿菌感染的情況。該養殖場應及時進行治療或淘汰，徹底清掃消殺后再重新飼養仔豬，制定合理的免疫程序，科學進行防控；同時，要加強飼養管理，營造良好環境，減少疾病的發生，堅持以防控為主的綜合防治措施，以免造成不必要的經濟損失。

4 結論

本試驗對出現呼吸異常的仔豬的病料進行細菌分離培養、染色鏡檢、16S rDNA分子生物學鑒定出該病料中有巴氏桿菌，證明該養殖場中出現呼吸困難的豬受到巴氏桿菌的感染。本試驗為豬巴氏桿菌的分離鑒定及進一步研究致病機理提供參考。