草魚NK-lysin基因生物信息學分析

張夢帆，王進千，劉麗霞，王 瑞

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州730030）

NK-lysin是一種抗菌肽，由機體自然殺傷細胞和毒性T細胞分泌[1]。NK-lysin作為一種抗菌肽在生物體內分布比較廣泛且具有高效廣譜抗菌活性，能夠分泌到淋巴細胞外發揮免疫防御功能[2-3]。NK-lysin具有與膜結合的能力，能夠改變細胞膜的完整性，深入細胞質內，進而導致細菌基因組降解，與顆粒溶素在結構和功能上有著很大的相似性[4]。NK-lysin是鞘脂激活蛋白樣蛋白（saposin-like protein，SAPLIP）家族的成員，具有鞘脂激活蛋白B（saposin B）結構域和6個保守的半胱氨酸，能夠殺滅細菌、病毒、寄生蟲和腫瘤細胞等[5]。魚類NK-lysin的抑菌種類中包括一些常見的水產動物病原菌。NK-lysin有助于魚類抗菌藥物的研發，可為魚類的細菌性研究做出貢獻，也可為其他細菌性疾病的防治奠定一定的基礎[5]。

草魚屬鯉形目、鯉科、雅羅魚亞科，是我國最大產量的淡水養殖魚類[6]。草魚在養殖過程中生病率和死亡率很高[7]。NK-lysin基因是重要的免疫基因，對這一基因的生物信息學分析可以對以后魚類的免疫提供參考。

1 材料與方法

1.1 NK-lysin基因序列

草魚NK-lysin基因的氨基酸序列來自https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，Cinkl登錄號為kx631937，其序列為：M LP CIL LA TL LI SSV C AF DM EM HR G N F T E D E LE QIS GE M APA QQ LPG LC WA C KW A M G K V K GL ISR TA T PSDI KR A LS HVC DE IG F L K F M C R I FV NK YL G VL IEE LS TTDD AR TIC V H V G V C。

1.2 NK-lysin基因序列的開放閱讀框分析

使用NCBI網站中http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html在線分析軟件進行NK-lysin基因序列的開放閱讀框分析。

1.3 NK-lysin基因的理化性質分析

利用http://web.expasy.org/protparam/網站中ProtParam工具對NK-lysin基因進行理化性質參數的分析。

1.4 NK-lysin基因的疏水性/親水性預測與分析

利用ProtScale在線預測工具http://web.expasy.org/protscale/對草魚NK-lysin基因進行疏水性/親水性的預測與分析。

1.5 NK-lysin的基因跨膜區分析

利用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網站中在線蛋白質跨膜區分析工具TMHMM對草魚NK-lysin進行跨膜區的預測。

1.6 NK-lysin基因的二級結構預測

https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html運用網站二級結構預測的工具進行草魚NK-lysin基因的二級結構預測。

1.7 NK-lysin基因的磷酸化位點/N-糖基化位點分析

利用網站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/預測NK-lysin基因的磷酸化位點，利用網站http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/預測NK-lysin基因的N-糖基化位點。

2 結果與分析

2.1 草魚NK-lysin蛋白質開放閱讀（ORF）預測（見圖1）

ORF的識別是證明一個新的DNA序列為特定的蛋白質編碼基因的部分或全部的先決條件[8]。

由圖1可知，NK-lysin基因開放閱讀框全長213 bp，起始密碼子為ATG，編碼121個氨基酸。

圖1 NK-lysin基因ORF分析結果Fig.1 Analysis results of NK-lysin gene ORF

2.2 草魚NK-lysin基因的氨基酸組成（見表1）

草魚NK-lysin的分子式為C591H951N155O170S14，氨基酸數量121個。由表1可知，草魚NK-lysin共有20種基本氨基酸。NK-lysin的分子質量為13 396.83 u，等電點為5.53，帶負電殘基總數（Asp+Glu）14個，正電荷殘基總數（Arg+Lys）11個。在體外，NK-lysin基因半衰期為在哺乳動物網織紅細胞內為30 h。在酵母中半衰期大于20 h，在大腸桿菌內半衰期大于10 h。不穩定指數計算為44.09，這將NK-lysin基因歸類為不穩蛋白。疏水性總平均值（GRAVY）為0.361，說明草魚NK-lysin為疏水蛋白。

表1 草魚NK-lysin基因的氨基酸組成Tab.1 Amino acid composition of NK-lysin gene in grass carp

2.3 草魚NK-lysin親水性/疏水性預測與分析（見圖2）

圖2 草魚NK-lysin親水性/疏水性預測與分析Fig2 Prediction and analysis of hydrophilicity/hydrophobicity of grass carp NK-lysin

由圖2可知，草魚NK-lysin親水性最強位點出現在第27位苯丙氨酸，分值為-2.222，草魚NK-lysin疏水性最強的位點出現在第8位丙氨酸。草魚NK-lysin蛋白平均疏水性為0.361，疏水肽鏈分布在整個氨基酸序列中，且明顯多于親水性肽鏈，預測結果表明草魚NK-lysin是一種疏水蛋白質。

2.4 草魚NK-lysin跨膜區分析

使用在線蛋白質跨膜區分析工具TMHMM軟件對草魚NK-lysin進行跨膜區分析。結果顯示，草魚NK-lysin不含跨膜區，說明草魚NK-lysin不是跨膜蛋白質。

2.5 草魚NK-lysin蛋白質二級結構預測（見圖3）

圖3 草魚NK-lysin蛋白質二級結構預測Fig.3 Prediction of the secondary structure of grass carp NK-lysin protein

由圖3可知，α螺旋有25個氨基酸殘基參與占20.66%，延伸連有38個氨基酸殘基參加占31.40%，無規則卷曲有58個氨基酸殘基參與占47.93%。

2.6 草魚NK-lysin蛋白質的磷酸化位點/N-糖基化位點分析（見圖4、圖5）

由圖4、圖5可知，草魚NL-lysin蛋白質有6個Ser（Ser13、Ser36、Ser64、Ser70、Ser77、Ser106）位點和6個Thr（Thr9、Thr28、Thr66、Thr68、Thr107、Thr108）位點，總計12個潛在的磷酸化位點，但是僅有1個N-糖基化位點Asn26。

圖4 草魚NK-lysin蛋白質的磷酸化位點Fig.4 Phosphorylation site of grass carp NK-lysin protein

圖5 草魚NK-lysin蛋白質的N-糖基化位點分析Fig.5 Analysis of N-glycosylation site of grass carp NK-lysin protein

3 討論

NK-lysin基因是Andresson等[9]在豬的脾臟和骨髓中首次發現的一種新的抗菌肽。王改玲等[5]研究表明，NKlysin基因在脾臟的表達量中極高，在頭腎、腮、心臟等部位也保持著較高的表達量，而這些部位恰恰是免疫器官，同樣說明NK-lysin基因發揮著重要的免疫作用。通過生物軟件分析草魚NK-lysin的生物信息學信息，有利于對該基因進行深入研究并進一步探究其作用機制[10]。本研究從生物信息學角度解析草魚NK-lysin基因的序列特征。研究發現，草魚NK-lysin基因全長121個氨基酸，通過理化性質的分析和親疏水性的預測和分析可以確定草魚NKlysin是一種疏水蛋白，其二級結構以無規則卷曲結構為主。蛋白質磷酸化在細胞信號轉導的過程中起重要作用，是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍、最重要的機制，可使細胞產生應激反應或新陳代謝發生改變，從而起到調節蛋白質在信號轉導中的作用，改變基因表達、細胞生長和分化[11]。草魚NK-lysin蛋白有12個潛在的磷酸化位點，這些位點可能影響到某些細胞的代謝過程和信號轉導。

4 結論

草魚NK-lysin基因由121個氨基酸殘基組成，屬于疏水性蛋白，無跨膜區，具有潛在的磷酸化位點和糖基化位點，研究結果可為草魚免疫相關基因調控的深入研究提供參考。