γ-聚谷氨酸對小尾寒羊瘤胃發酵及菌群結構的影響

曹琪娜，張艷梅，敖長金，張騰龍，張興夫，白 晨，趙亞波，齊景偉

（內蒙古自治區動物營養與飼料科學重點實驗室，內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018）

γ-聚谷氨酸（Poly-γ-glutamate，γ-PGA）是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過γ-谷氨酰鍵結合形成的一種可生物降解的水溶性陰離子聚合物[1]，由傳統發酵食品（日本納豆等）中的芽孢桿菌類（主要為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）發酵而成，其分子中富含-COOH、-CO-、-NH-等多種活性基團，電荷密度高，具有優良的保水性、可食用性、緩釋性和生物相容性等，降解后為小分子氨基酸，不會帶來二次污染，是一種新型高分子材料[2]。作為一種可食用、無毒無害的生物聚合物，γ-PGA 及其衍生物被廣泛應用于食物增稠劑、保濕劑、苦味消除劑、冷凍保護劑、藥物載體、重金屬吸收劑和動物飼料添加劑等物質中。研究指出，作為食品補充劑，γ-PGA 在體內可以通過增加鈣的溶解度和腸道吸收來有效地提高鈣的生物利用度，從而減少人體的骨質流失[3]。添加γ-PGA于動物飼糧中可促進機體對鈣等礦物質的吸收，有利于降低飼料中礦物質的添加量，并能增加蛋殼強度和減少動物體內脂肪的沉積[4]。Jin 等[5]研究發現，口服γ-PGA可有助于將小鼠腸道微生物菌群調節為益生菌來增加小鼠腸道內乳酸菌的豐度，同時減少梭菌數量，具有穩定小鼠腸道微生物和增加腸道微生物組成多樣性的作用。γ-PGA 作為飼料添加劑在反芻動物上的研究鮮有報道。因此，本試驗通過16S rDNA 高通量測序分析技術，探討飼糧中添加γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃菌群結構的影響，為其作為飼料添加劑的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物的選擇與飼養管理 本試驗選取檢疫合格、體重為（37.1±0.5）kg 的3 月齡小尾寒羊公羊24只，采用全混合飼糧（TMR），日飼喂2 次（07:00、17:00），自由采食，全天自由飲水。

1.2 試驗藥品與儀器設備γ-聚谷氨酸購買自西安瑞盈生物科技有限公司，分子質量為20 ku 的冷凍干燥粉，純度為99%。DNA 提取試劑盒（南京建成生物工程研究所）、pH 計（貝爾分析儀器有限公司，BPH-7200）、全自動酶標儀（美國BIOTEK 公司，Synergy HT 型）、瘤胃液采樣器（上海硅狄科學儀器有限公司，GCYQ-1-B）及氣相色譜儀（美國Agilent 公司，6890N）。

1.3 試驗設計與基礎飼糧 采用單因素完全隨機試驗設計，將小尾寒羊隨機分成對照組和試驗組，試驗預試期14 d，正試期7 d。對照組飼喂基礎飼糧，試驗組在基礎飼糧中添加20 g/（只·d）γ-PGA?；A飼糧參考《肉羊飼養標準》（NY/T816-2004）配制，其中NaHCO3按20 g/（只· d）添加，基礎飼糧組成及營養成分見表1。

1.4 瘤胃發酵參數測定

1.4.1 瘤胃液的采集與處理 在正試期第7 天晨飼2 h后通過瘤胃液采樣器采集試驗羊的瘤胃液，并將采集到的瘤胃液用4 層紗布過濾（在實驗室內進行）后先用pH 計測定瘤胃液pH，再將濾液等體積充分混勻后轉入凍存管后立即投入液氮罐中臨時保存，再將其轉移到實驗室后放入-80℃冰箱凍存備用。對照組和試驗組每組共有6 個樣品，將樣品送至上海桑格信息技術有限公司進行分析。

表1 基礎飼糧組成及營養成分（干物質基礎）

1.4.2 測定指標 粗蛋白質（CP）、粗脂肪（EE）、中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）、鈣（Ca）、磷（P）及代謝能（ME）參照張麗英等[6]的方法測定，氨態氮（NH3-N）參照馮宗慈等[7]的方法測定，微生物蛋白（MCP）和揮發性脂肪酸（VFA）均參照周奕毅[8]的方法（氣相色譜儀法）測定。

1.5 DNA 樣品提取、擴增和Miseq 測序

1.5.1 DNA 的提取 使用DNA 提取試劑盒并按照試劑盒說明書嚴格操作，提取出樣品中的DNA。

1.5.2 PCR 擴增 樣品DNA 擴增目的片段為V3+V4 區，其引物為338F-806R，引物序列為338F：5'-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3'、806R：5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3'。

1.5.3 Miseq 測序 由上海桑格信息技術有限公司使用Miseq 2500 PE 250 平臺上機測序樣品Miseq。

1.6 統計分析 使用SAS 9.0 軟件進行統計分析，采用t檢驗方法分析處理試驗數據，分析結果以平均值±標準差表示，P＜0.05 定義為差異顯著。

2 結果與分析

2.1γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃發酵參數的影響 由表2 可知，對照組與試驗組小尾寒羊的瘤胃液pH、丙酸、丁酸、乙酸/丙酸及MCP 間無顯著差異。試驗組小尾寒羊的瘤胃液NH3-N（P＜0.01）、乙酸（P＜0.05）濃度均高于對照組。

表2 γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃發酵參數的影響

2.2 總DNA 質檢結果 12 個瘤胃液樣品中總DNA 濃度、純度及質量均符合 Illumina Miseq 平臺測序要求，可進一步用于后續試驗。

2.3 16S rDNA 基因v3+v4 區域擴增結果 由圖1 可知，2 組試驗羊瘤胃液樣品中的16S rDNA 基因V3+V4 區擴增條帶大小正確，濃度適宜且條帶單一，可用于后續測序試驗。

圖1 試驗樣品16S rDNA 基因V3+V4 區域的擴增結果

2.4 操作分類單位（OTU）數量 通過Illumina Miseq測序結束后，OTU 劃分樣品的序列，并根據不同樣品的聚類信息繪制韋恩圖（Venn graph）。試驗組樣品獲得97 個，對照組樣品獲得86 個，2 組間共享的OTU為596 個，飼糧添加γ-PGA 后小尾寒羊瘤胃菌群多樣性升高。

2.5 OTU 稀釋曲線和 OTU Shannon 稀釋曲線 本試驗通過獲取的OTU 數據，利用隨機抽取的序列數及OUT數目去建立曲線，得出每組樣品的稀釋曲線，用以表明樣品測序出的數據量能否反映出瘤胃液中的物種多樣性。由圖3、4 可知，當測序深度較小時，OTU 數目發生劇烈變化，并隨著測序深度的增加而增高。測序深度達到15 000reads 數時，稀釋曲線趨于穩定，說明測序深度已覆蓋到瘤胃液樣品中所有的菌群物種中，測序結果可靠。測序深度達5 000 reads 時，Shannon 曲線趨于飽和狀態，說明此測序量足夠，可以進行樣品菌群多樣性分析。

圖2 小尾寒羊瘤胃液菌群韋恩圖

圖3 小尾寒羊瘤胃細菌OTU 稀釋曲線

圖4 小尾寒羊瘤胃細菌OTU Shannon 稀釋曲線

2.6 OTU Alpha 多樣性分析 基于OUT 的結果，計算出每組樣品的Alpha 多樣性。由表3 可知，試驗組Chao-1 指數高于對照組，說明飼糧添加γ-PGA 使小尾寒羊瘤胃液中菌群豐富度升高，但差異不顯著。試驗組的Shannon 指數高于對照組（P＜0.01），說明飼糧添加γ-PGA 能夠提高小尾寒羊瘤胃菌群多樣性。2 組覆蓋率均大于99%，說明采集的樣品足以反映瘤胃菌群情況。

表3 樣品Alpha 多樣性指數

2.7 瘤胃菌群結構分析

2.7.1 門水平 由表4、圖5 可知，小尾寒羊瘤胃液中總共涉及17 個菌門，主要包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養菌門（Synergistetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、螺旋菌門（Spirochaetae）、藍藻門（Cyanobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、絲狀桿菌門（Fibrobacteres）及軟壁菌門（Tenericutes）等，其中所含的主要細菌門即優勢菌門為擬桿菌門、厚壁菌門及互養菌門，占總細菌門比例的90% 以上。試驗組小尾寒羊瘤胃液中擬桿菌門的相對豐度高于對照組，厚壁菌門的相對豐度低于對照組，互養菌門的相對豐度高于對照組，但差異均不顯著。與對照組相比，飼糧添加γ-PGA 可降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細菌門及藍藻門的相對豐度（P＜0.01），增加放線菌門的相對豐度（P＜0.01）。

表4 γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃菌群門水平上相對豐度的影響 %

圖5 門水平上瘤胃菌群分布圖

2.7.2 屬水平 在本試驗中小尾寒羊瘤胃液菌群總共涉及188 個屬種。由表5、圖6 可知，相對豐度較高的29 個屬種占各樣品中總菌屬的90% 以上，其中所包含的6 個菌屬的相對豐度較高，分別是普雷沃氏菌屬（Prevotella）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、奎因氏菌屬（Quinella）、Fretibacterium、Prevotellaceae_UCG-003及解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）。試驗組普雷沃式菌屬的相對豐度高于對照組，對照組瘤胃球菌屬的相對豐度高于試驗組，但差異均不顯著。試驗組小尾寒羊瘤胃液中解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）的相對豐度高于對照組（P＜0.01）。

2.7.3 組間差異顯著性檢驗 由圖7 可知，試驗組小尾寒羊瘤胃液中解琥珀酸菌屬的相對豐度高于對照組（P＜0.01）。

3 討 論

3.1γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃發酵參數的影響 瘤胃pH是反映反芻動物瘤胃內環境的重要指標之一，其高低可直接影響瘤胃微生物的生長代謝[9]，并可反映反芻動物瘤胃內的發酵及其有機酸的代謝狀況。研究指出，瘤胃液pH 的正常范圍是5.5～7.5，對其影響最大的主要是飼糧結構和營養水平[10]。本試驗結果顯示，2 組試驗羊瘤胃液的pH 差異不顯著，且均在正常范圍內，說明飼喂γ-PGA 后小尾寒羊的瘤胃發酵和代謝均屬正常。瘤胃微生物通過發酵飼料中的碳水化合物產生揮發性脂肪酸（VFA），并在此發酵過程中釋放出的能量供微生物生長繁殖利用。VFA 是反芻動物主要的能量來源物之一，其合成受到飼糧結構、品質及瘤胃微生物活性等的調控，其中乙酸、丙酸和丁酸占總VFA 的95%以上[11]。本試驗中，2 組飼糧經瘤胃微生物發酵后的主要產物為乙酸，并且試驗組小尾寒羊瘤胃中的乙酸含量顯著高于對照組，說明飼糧中添加γ-PGA 能夠提高粗纖維的降解率，其可能是通過提高纖維分解菌（解琥珀酸菌屬）的豐度所致。γ-PGA 分子鏈中含有大量的羧基[12]，可能也是引起試驗組乙酸升高的原因，有待進一步研究分析。2 組試驗羊瘤胃丙酸和丁酸含量沒有顯著差異。研究指出，乙酸/丙酸越高，奶牛的氫濃度和產甲烷菌數越高，其擬桿菌門和厚壁菌門的豐度越低[13]。本試驗發現，試驗組瘤胃乙酸/丙酸低于對照組，這可能是飼喂γ-PGA 后小尾寒羊擬桿菌門和互養菌門的相對豐度有所提高的原因。

表5 γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃菌群屬水平上相對豐度的影響

圖6 屬水平上瘤胃菌群分布圖

反芻動物瘤胃中的NH3-N 主要來源于食糜中蛋白質的降解，是大部分微生物生長繁殖所需的原料，因此可用NH3-N 濃度反映瘤胃內微生物的活力[14]。研究表明，NH3-N 濃度在6～30 mg/dL 時，最適宜微生物的生長繁殖[15]。反芻動物瘤胃微生物經過復雜的發酵過程合成MCP，NH3-N 是瘤胃微生物合成MCP 的原料，過低及過高的NH3-N 濃度均不利于MCP 合成。研究指出，日糧添加谷氨酸渣可降低瘤胃NH3-N，提高MCP 含量[16]。本試驗結果顯示，試驗組小尾寒羊瘤胃NH3-N 濃度極顯著高于對照組，并且濃度在6～30 mg/dL，其可能是由于γ-PGA 特異性地增加了瘤胃內蛋白分解菌（如普雷沃式菌屬）的數量而造成的。試驗組MCP 含量略高于對照組，說明飼糧中添加γ-PGA 有利于小尾寒羊瘤胃MCP 合成。

3.2γ-PGA 對小尾寒羊瘤胃菌群結構的影響 瘤胃是反芻動物特有的消化器官，因含有豐富的微生物菌群而具有超強的降解纖維物質的能力，能將高纖維素物質轉化為動物性蛋白。瘤胃微生物主要包括細菌、真菌和原蟲，在消化飼料的過程中三者共同協作完成碳水化合物和蛋白質等的分解，并具有調控反芻動物的生產效率及健康狀況等功能[17]，細菌是瘤胃內種類和數目最多且最為復雜的微生物。反芻動物瘤胃內的細菌主要分布于擬桿菌門和硬壁菌門中，對瘤胃內容物的發酵過程具有重要的作用[18]。本試驗結果表明，飼糧添加γ-PGA 可極顯著提高小尾寒羊瘤胃菌群多樣性。曾燕[19]研究指出，擬桿菌門和厚壁菌門是綿羊胃腸道中主要的優勢菌門。本試驗結果顯示，飼糧中添加γ-PGA 后，在小尾寒羊瘤胃液菌群的門水平上，擬桿菌門和互養菌門的相對豐度分別提高了6.3%和3.6%。互養菌屬中所屬的各類菌種均具有降解氨基酸的能力。研究指出，從羊的反芻食物中分離出的互養菌屬能以精氨酸和組氨酸作為底物，降解飼糧中存在的毒素，幫助宿主動物生存[20]。本試驗中，飼糧中添加γ-PGA 可極顯著降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細菌門及藍藻門的相對豐度，極顯著增加放線菌門的相對豐度；飼糧添加γ-PGA 后，小尾寒羊瘤胃液中普雷沃式菌屬的相對豐度提高了8.2%。普雷沃式菌屬為厭氧的革蘭氏陰性菌，是瘤胃內重要的淀粉降解菌，還可以降解多種代謝產物如蛋白質、多糖及小肽等。

反芻動物的飼料成分主要以粗飼料為主，瘤胃中的纖維降解菌可以降解粗飼料中的纖維物質，將其轉化為營養物質而滿足宿主動物的能量需求[21]。產琥珀酸擬桿菌、黃色瘤胃球菌及白色瘤胃球菌是瘤胃內的主要纖維降解菌[22]，其中解琥珀酸菌屬中的產琥珀酸擬桿菌為厭氧型革蘭氏陰性菌，具有降解黃白瘤胃球菌所不能降解的纖維素的能力[23]，并且還具有較強的耐抗生素能力。本試驗結果表明，飼糧添加γ-PGA 后極顯著提高了小尾寒羊瘤胃液內解琥珀酸菌屬的相對豐度。

4 結 論

本研究結果表明，飼糧中添加γ-PGA 可極顯著提高小尾寒羊瘤胃乙酸、NH3-N 及菌群多樣性；γ-PGA可在門水平上極顯著降低小尾寒羊瘤胃液中軟壁菌門、螺旋菌門、未注釋細菌門及藍藻門的相對豐度，極顯著增加放線菌門的相對豐度，可提高擬桿菌門和互養菌門的相對豐度；γ-PGA 可在屬水平上極顯著提高小尾寒羊瘤胃內解琥珀酸菌屬的相對豐度，也可提高普雷沃式菌屬的相對豐度但差異不顯著。綜合分析，γ-PGA 具有優化小尾寒羊瘤胃微生態環境的作用，能改善瘤胃的發酵，提高飼料利用率。