siRNA 干擾牦牛Bmal1 基因對顆粒細胞激素分泌的影響

趙明旺，張 君，徐尚榮，黃 榮，舒 適，彭 巍，張琳欽

（1.青海大學農牧學院，青海西寧 810016；2.青海大學畜牧獸醫科學院，青海西寧 810016）

牦牛是高原地區的全能家畜[1]。在我國，牦牛的需求量大，市場廣泛，牦牛養殖業是高原畜牧業經濟和西北地區農業生產中不可或缺的組成部分，但受環境等因素影響，牦牛的繁殖能力普遍不高。因此，提高牦牛的繁殖力有助于牦牛產業的發展。

作為生物鐘家族的核心成員之一，Bmal1（Brain and muscle arnt-like 1）主要以異源二聚體的形式在哺乳動物生物鐘轉錄、翻譯反饋環中起到正調節的作用[2]。研究發現，Bmal1基因能參與哺乳動物生殖生理的調控[3-4]。有研究表明，敲低顆粒細胞Bmal1 可顯著降低動物COX2 的表達，從而影響前列腺素的合成[5-6]；Alvarez 等[7]研究發現敲除Bmal1基因后，雌雄小鼠不僅出現不孕不育現象，而且孕激素合成的重要調節蛋白（Star）功能出現降低，導致小鼠類固醇激素合成及分泌減少，影響雌雄鼠的生殖能力。Cyp19a1是雌激素合成的關鍵基因，參與性激素的合成[8]；Star作為類固醇激素合成的限速酶，主要負責編碼的蛋白能夠將線粒體外膜的膽固醇轉運到線粒體內膜，Star基因是類固醇激素合成的重要基因[9]。關于Bmal1基因的表達對牛繁殖生理的影響鮮有報道。因此，本實驗以體外培養的牦牛卵巢顆粒細胞作為研究對象，用siRNA 干擾Bmal1基因的表達，探討抑制Bmal1基因表達是否對牦牛顆粒細胞激素分泌有所影響，以期為闡明Bmal1基因參與牦牛卵泡發育的分子機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 西寧市裕泰屠宰場母牦牛。

1.1.2 主要試劑 DMEM、10% 胎牛血清購于Gibico公司；TransZol Up Plus RNA Kit 和蛋白提取試劑盒購自北京全式金生物公司；反轉錄試劑盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTM購自大連寶TaKaRa 生物工程有限公司；siRNA-Mate 轉染試劑購自上海吉瑪制藥技術有限公司；ELISA 試劑盒購自江蘇酶標生物科技有限公司；BMAL1 和GAPDH 抗體購自Abcam 公司；CYP19A1和STAR 抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養箱為美國Thermo 產品；qRTPCR 儀為Applied Biosystems 產品；多功能酶標儀為Biotek 產品；蛋白電泳儀為Bio-rad 產品；多功能化學發光儀為Proteinsimple 產品。

1.2 牦牛顆粒細胞的體外分離與培養

1.2.1 牦牛顆粒細胞的體外分離 采集健康牦牛的卵巢置于盛有36℃生理鹽水及雙抗的保溫杯中，在2～6 h 內送回實驗室細胞間。剪掉卵巢上的結締組織，將卵巢用生理鹽水清洗3 次。用10 mL 注射器吸取卵泡液于盛有2 mL 5%胎牛血清（FBS）的15 mL 離心管中，常溫離心5 min（1 200 r/min），棄去上清液，PBS 離心清洗5 次。用細胞篩過濾，得到較為純凈的牦牛顆粒細胞。

1.2.2 牦牛顆粒細胞的體外培養 將收集好的牦牛顆粒細胞按照4×105/mL 接種于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM 基礎培養基，分別裝入細胞瓶中培養。24 h 后觀察細胞生長情況，棄掉原培養基，用PBS 清洗3 遍，再換上新的培養基繼續培養。48 h 后，細胞長滿瓶底時，將細胞傳代至6 孔板中，細胞量為1.5×105個/孔，然后在37℃，5% CO2培養箱中培養。

1.3 Bmal1 siRNA 細胞轉染 培養20 h，待細胞長至30%～50%時，對細胞進行轉染。①將200 μL 無血清培養基加入無菌EP 管中，再加入6 μL Bmal1 siRNA 或Bmal1 siRNA NC（Negative Control）；②每管加入10 μL siRNA-Mate，充分混勻，室溫靜置10 min；③給6 孔板每孔換上2 mL 預熱的新鮮培養基；④將靜置完畢的轉染混合物分別加入孔中，然后在37℃、5% CO2培養箱中培養。對照組和實驗組各設置3 個復孔。

siRNA 干擾片段帶有熒光標記染色，當將其對體外培養的卵巢顆粒細胞進行轉染6 h 后，棄去細胞培養基，輕輕地使用PBS 吹吸細胞3 次，然后在熒光顯微鏡下檢測轉染效率。

1.4 引物設計與合成 根據NCBI 數據庫已知牦牛各基因序列，利用Oligo7.0 軟件分別設計Bmal1、激素合成相關基因Cyp19a1和Star，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Bmal1基因干擾片段由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成。引物序列如表1。

1.5 總RNA 提取及cDNA 的合成 棄去細胞培養液，PBS 清洗2 遍后，用TransZol Up Plus RNA Kit 對細胞的總RNA 進行提取，經測定各組RNA 濃度及純度后，每組按700 ng 的量進行反轉錄。反轉錄按照試劑盒PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行。cDNA 置于-20℃保存備用。

1.6 ELISA 檢測細胞培養基中雌二醇（E2）和孕酮（P4）含量 細胞轉染72 h 后，收集各組的細胞培養液，參照ELISA 試劑盒說明書分別檢測E2和P4含量。

1.7 qRT-PCR 反應按照試劑盒（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）說明書進行，體系為20 μL：Premix 10 μL，Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL，上、下游引物各0.8 μL、DNA 模板2 μL；退火溫度為59℃。反應程序：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸34 s，共35 個循環。每組實驗樣品進行3 次重復，每個樣品的目的基因和內參基因GAPDH分管同板以相同條件擴增。

1.8 Western blot

1.8.1 總蛋白的提取 在利用si-Bmal1 進行干擾處理72 h后，將對照組和實驗組的顆粒細胞進行總蛋白提取。將轉染后的細胞消化收集后，用PBS 離心清洗（700 r/min），棄掉上清液；向細胞沉淀加入1 mL TPEB，然后劇烈震蕩15 s，冰上孵育30 min；最后14 000 r/min 離心10 min，小心收集上清液，得到的總蛋白置于-80℃保存備用。

表1 引物序列

1.8.2 Western blot 將變性后的蛋白通過SDS-PAGE（8%分離膠）分離；電泳結束后，利用PVDF 膜將蛋白轉印到膜上；轉膜結束后，5%脫脂牛奶37℃封閉3 h；將按一定的比例稀釋后的一抗：BMAL1（1:2500）；CYP19A1（1:500）；STAR（1:600）；GAPDH（1:3 000），與PVDF 膜4 ℃冰箱過夜孵育；將PVDF 膜取出，TBST 清洗1 h，然后室溫孵育二抗2 h；將PVDF 膜取出，用TBST 在37℃環境下清洗2 h；配置適量的發光液，加到PVDF 膜上反應2 min 左右，最后曝光儀器上曝光并拍照。每組實驗樣品進行3 次重復。

1.9 統計分析 根據Ct 值，采用2-△△Ct法，計算不同基因的相對表達量。Western blot 結果Alpha View SA軟件進行計算蛋白相對表達量。用IBM SPSS Statistics 19.0 統計軟件進行數據分析，組內差異進行t檢驗，同組不同時間點的數據用單因素方差分析。所有數據以均數±標準差表示。*表示差異性顯著（P＜0.05），**表示差異性極顯著（P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 siRNA 轉染和干擾效率的檢測 轉染6 h 后，在熒光顯微鏡下檢測轉染效率。如圖1 所示，經過帶有熒光標記的siRNA 轉染后，在超過80%的細胞中都能觀察到綠色的熒光信號，表明siRNA 的轉染效率可達到80%以上，合成的干擾片段可用于后期實驗。

圖1 Bmal1 siRNA 轉染效果

將牦牛卵巢顆粒細胞進行分組，用si-Bmal1和陰性對照NC 進行轉染，48 h 后提取細胞RNA，應用qPCR 檢測si-Bmal1干擾效率。如圖2 所示，si-Bmal1mRNA 相對表達量與對照組相比極顯著下調，干擾效率大于50%，si-Bmal1干擾片段可用于后期實驗。

圖2 Bmal1 siRNA 的干擾效率

2.3 ELISA 檢測細胞培養基中E2和P4含量 在使用si-Bmal1對體外培養的牦牛卵巢顆粒細胞進行轉染72 h后，測定細胞培養液中的激素濃度。如圖3 所示，在siRNA 干擾Bmal1后，E2（P＜0.05）和P4（P＜0.01）濃度低于對照組。

圖3 干擾Bmal1 表達對顆粒細胞激素分泌的影響

2.4 siRNA 干擾Bmal1對激素分泌基因表達的影響在使用si-Bmal1干擾處理72 h 后，用qPCR 檢測對照組和實驗組的顆粒細胞激素合成相關基因Cyp19a1和Star的表達。如圖4 所示，使用siRNA 進行干擾后，Cyp19a1和Star的表達下降；其中，Cyp19a1的表達相對于對照組下調極顯著。

圖4 干擾Bmal1 對Cyp19a1 和Star 表達的影響

2.5 siRNA 干擾Bmal1對激素分泌相關蛋白表達的影響 用Western blot 檢測BMAL1 蛋白、E2 合成相關蛋白CYP19A1 以及孕酮合成的相關基因STAR 的表達。如圖5 所示，siRNA 片段可以降低BMAL1 蛋白的表達（P＜0.01），同時CYP19A1 蛋白表達也在抑制Bmal1后降低（P＜0.05），STAR 的降低趨勢不顯著。

圖5 干擾Bmal1 對BMAL1、CYP19A1 和STAR 表達的影響

3 討 論

作為卵泡重要細胞之一，顆粒細胞在多種激素和信號分子的作用之下增殖和分化，進而影響卵泡的發育和成熟[10]。在哺乳動物卵巢中，顆粒細胞分泌的E2和P4可以促進卵泡的發育、成熟和排卵，對卵巢生長有著重要意義[11-12]。此外，顆粒細胞在發育過程中通過多條信號通路（如mTOR 信號通路和cAMP 信號通路等）與卵母細胞之間相互作用，而且這些信號通路之間同樣存在相互影響的關系，最終決定卵泡的成熟或閉鎖[13-14]。趙明旺等[15]研究發現，牦牛顆粒細胞中存在Bmal1基因的表達。因此，本研究以體外牦牛卵巢顆粒細胞作為研究對象，應用siRNA 干擾顆粒細胞細胞Bmal1基因的表達，探究Bmal1基因對牦牛卵泡發育功能的影響。

生物鐘基因參與調控雌性動物下丘腦-垂體-性腺軸（HPG），從而影響雌性動物的生殖代謝活動[16-17]。Chu 等[18]研究發現，Bmal1基因的晝夜節律性表達對大鼠顆粒細胞和黃體細胞的生長有影響，敲低Bmal1基因的表達不僅破壞了其表達的節律性，而且顆粒細胞和黃體細胞的凋亡水平顯著增加。在激素分泌及合成方面，動物卵巢激素受體以及合成基因的編碼區上游被證實存在著生物鐘調控元件E-box、RORE 和 D-box 的序列，表明卵巢關鍵功能基因啟動子區域中的這些調控元件可能在生物鐘系統的作用下發揮調控激素分泌的作用[19]。Zhang 等[20]研究發現，人類卵巢顆粒細胞中的Bmal1和Sirt1基因敲除后，顆粒細胞的雌激素分泌下降，并且雌激素合成相關芳香化酶的表達也減弱，而細胞中Bmal1和Sirt1基因過表達處理后則相反；該研究表明Bmal1基因參與卵巢顆粒細胞雌激素的分泌。也有研究指出，Bmal1基因的缺失或突變能夠下調類固醇急性調節蛋白的表達量，抑制卵巢顆粒細胞孕酮的分泌[6,21-22]。Chu等[23]敲除小鼠顆粒細胞中的Bmal1基因，導致Lepr、Cyp19a1和Cyp11a1的表達出現下調，而且E2分泌量下降。Wang 等[22]研究指出生物鐘基因的缺失能影響Star基因的表達，使得P4的合成受到影響。本研究應用ELISA 檢測得出干擾Bmal1基因的表達后顆粒細胞培養基中E2和P4的分泌量下降，并且最后通過mRNA 和蛋白水平檢測了激素分泌相關基因的表達在干擾Bmal1基因的表達后都降低，這說明Bmal1基因參與牦牛卵巢激素合成的調節。在對激素合成蛋白表達量檢測結果發現，干擾Bmal1基因表達后，Cyp19a1 蛋白的表達并沒有像其mRNA 一樣被顯著性下調；而Star 蛋白下調不顯著，推測下調Bmal1基因后對Cyp19a1和Star基因翻譯成相應蛋白的過程干擾程度減弱，具體機制還需要進一步探究。本研究結果表明，Bmal1基因參與調控牦牛卵巢顆粒細胞分泌雌激素和P4。這為進一步研究Bmal1基因在牦牛顆粒細胞的生長作用的調節提供一定的理論依據。

4 結 論

本實驗結果表明，敲低Bmal1基因能通過調控相關的基因導致體外培養牦牛顆粒細胞激素的分泌受到抑制，說明Bmal1基因在牦牛顆粒細胞凋亡和激素分泌的調控中起著重要作用。