不同運動方式和運動時間對小鼠睪酮分泌和精子生成的影響

張 姹 ，魏易焓，盧靜怡，王蕾蕾，常成杰，徐 暢，袁業現，尹 聰，束 剛*，江青艷

（1.華南農業大學動物科學學院，廣東廣州 510642；2.廣東省動物營養調控重點實驗室，廣東廣州 510642）

雄性動物的精子數量和活力是保證雌性動物受胎率、產仔數和子代健康的重要前提[1]。在雄性生殖系統中，睪丸和附睪是重要的性腺器官[2]。睪丸主要由睪丸曲細精管和管外組織組成，曲細精管是精子生成的場所[3]。睪丸生成的精細胞不具備運動與受精的能力，需要在附睪中完成精子成熟相應的形態變化和功能變化[4]。雄激素是維持性腺功能必不可少的激素[5]。

除性腺激素外，雄性動物生殖能力還受到營養、應激和運動等多種因素影響[6]。其中，運動是改善動物生殖機能的有效方式之一。在畜牧生產中，通常需要給種公豬配備運動場，滿足運動的需求，以保證精液品質[7-8]。目前研究運動對生殖能力影響的研究模型多為肥胖且生殖能力受損的小鼠[9]。有研究表明，高脂誘導肥胖大鼠長期負重游泳訓練可顯著增加大鼠的精子總數、增加精子活動率[10]。相反，間接性耐力會顯著增加肥胖大鼠的精子畸形率，降低精子總量[11]。可見不同的運動方式和運動強度對小鼠生殖機能的影響不一，但目前鮮有關于運動對健康青年小鼠生殖能力影響的報道。因此，本實驗主要研究力竭運動（Exhaustive Exercise，EE）、短期有氧運動（Acute Aerobic Exercise，AAE）和長期有氧運動（Chronic Aerobic Exercise，CAE）對健康青年雄性小鼠睪酮分泌和生殖的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 不同運動模型小鼠的構建 實驗所用雄性的C57BL/6J 小鼠均購自廣東省實驗動物中心（廣東佛山）。32 只11 周齡雄性小鼠按體重隨機分成4 組（n=8），分別是對照組（CON 組）、力竭運動組（EE 組）、短期有氧運動組（AAE 組）和長期有氧運動組（CAE 組）。EE組訓練方法：在跑步機上以10 m/min 的速度跑10 min后休息10 min，休息結束以10 m/min 的速度每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 持續訓練3 h，訓練結束后迅速采樣。AAE 組訓練方法：在跑步機上以10 m/min 的速度跑10 min 后休息10 min，休息結束在10 m/min 的速度基礎上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持續訓練1 h，訓練結束后迅速采樣。CAE 組訓練方法：在跑步機上以10 m/min的速度跑10 min 后休息10 min，休息結束后在10 m/min的速度基礎上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持續訓練1 h，每天按照上述方式重復訓練，每訓練5 d 休息2 d，訓練2 周后停止訓練，最后一次訓練結束后24 h 內采樣[12]。

1.2 性腺樣本的采集、HE 染色及統計方法 實驗結束后小鼠脫頸法處死，腹部涂抹75% 酒精，開腹后迅速采集一側完整睪丸和附睪置于4%的多聚甲醛中固定過夜，然后經過乙醇溶液脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。HE 染色過程：經二甲苯脫蠟，乙醇溶液脫水，蘇木精伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。

使用ImageJ 1.8.0 統計睪丸曲細精管空腔絕對面積。附睪尾每個樣品隨機選取10 個視野，統計該視野不規則附睪管的比率，最后求均值。小鼠處死后迅速分離附睪，轉移至1 mL、37℃生理鹽水中，剪刀剪碎附睪，37℃孵育10 min 后，移液槍輕輕吹勻精子懸浮液后，用血球計數板測定精子數量；將懸浮液均勻抹于玻片上風干，甲醇固定5 min，伊紅染色1 h，蒸餾水浸洗。風干后在400 倍光學顯微鏡模式下觀察2000 個精子細胞的形態，統計精子畸形率。

1.3 血清樣品檢測 采集小鼠全血，4℃、3000 r/min離心25 min，吸取上層血清-20℃保存備用。血清睪酮水平的檢測：采用Testosterone assey kit（USA，R&D system）檢測。

1.4 睪丸樣本的采集及熒光定量PCR 檢測 小鼠處死后分別取出取完整睪丸置于液氮中速凍，然后將樣品轉移至冰箱中-80℃保存。提取睪丸組織總RNA，利用試劑 TRIzol，常規方法抽提，熒光定量PCR 檢測睪丸中睪酮合成代謝轉運相關基因包括類固醇急性轉運蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，STAR）、3β-羥基類固醇脫氫酶異構酶2（Hydroxy-Delta-5-Steroid Dehydrogenase,3 Beta-And Steroid，3β-HSD）、17β羥類固醇脫氫酶（Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase，17β-HSD）、類固醇5α-還原酶1（Steroid 5 Alpha-Reductase 1，SRD5A1）、類固醇5α-還原酶2（Steroid 5 Alpha-Reductase 2，SRD5A2）和細胞色素P450 膽固醇側鏈裂解酶（Cytochrome P450scc，P450scc）。以β-actin作為內參，對獲得的數據進行處理。基于各目的基因與內參基因的擴增效率接近，根據公式計算目的基因相對于內參基因的比值來反映各基因的相對表達豐度：2-△△Ct=2-（Ct 目的基因-Ct 內參基因），其中Ct目的基因為目的基因的Ct 值，Ct內參基因為內參基因的Ct 值。

表1 熒光定量PCR 所用引物序列

1.5 統計分析 實驗結果用平均值±標準誤表示，采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件對數據進行單因素方差分析，P＜0.05 表示顯著差異。

2 結果

2.1 不同運動方式對雄性小鼠性腺重量及血清睪酮水平對比不同運動方式的結果發現，EE 可顯著增加小鼠睪丸組織重量，AAE 和CAE 對小鼠睪丸和附睪的組織重量均無顯著影響（圖1-A），組織重量按照小鼠體重校正。與對照組相比，EE 可顯著降低小鼠血清睪酮水平，AAE 對小鼠血清睪酮無顯著影響，而CAE 可顯著上調小鼠血清睪酮（圖1-B）。可見不同運動方式可能通過影響睪酮分泌水平，調節雄性生殖能力。

2.2 不同運動方式對血清睪酮代謝相關基因表達的影響 圖2 表明，EE 可降低STAR mRNA 的表達，AAE 對STAR 表達無顯著影響，而CAE 可上調STAR表達（P＜0.05）。不同運動訓練對睪丸3β-HSD、17β-HSD、SRD5A1、SRD5A2 的mRNA 表達均無顯著影響。由此提示，不同運動方式可能通過調控睪丸STAR mRNA 表達，從而影響血清睪酮水平。

圖1 不同運動方式對雄性小鼠性腺重量和血清睪酮的影響（n=8）

圖2 不同運動方式對小鼠血清睪酮及睪丸睪酮合成代謝相關基因表達的影響（n=8）

2.3 不同運動方式對睪丸曲細精管結構的影響 如圖3所示，對照組、AAE 組和CAE 組睪丸組織曲細精管排列緊密，睪丸間質無滲出；但EE 組曲細精管排列不緊密，間質可見細胞滲出；而CAE 組曲細精管空腔面積顯著低于其他3 組，說明精子生成較多。

2.4 不同運動方式對雄性小鼠附睪發育的影響 如圖4所示，EE 組小鼠附睪管排列不緊密，附睪管形狀不規則，間質可見滲出的精子。AAE 和CAE 組小鼠附睪管排列緊密，附睪管形狀規則，與對照組無明顯差異。提示EE 可損害附睪管管壁結構。

圖3 不同運動方式對小鼠睪丸曲細精管結構的影響（n=8）

2.5 不同運動方式對雄性小鼠精子品質的影響 進一步通過小鼠精子涂片HE 染色，發現EE 組精子總數雖無變化，但其畸形率顯著升高；相反，CAE 可顯著增加精子總數，顯著降低精子畸形率（圖5）。AAE 對小鼠精子總數和精子畸形率均無顯著影響。

圖4 不同運動方式對雄性小鼠附睪發育的影響（n=8）

圖5 不同運動方式對雄性小鼠精子品質的影響（n=8）

3 討 論

運動可以調節雄性動物生殖能力，也可以調控雄性動物血清睪酮水平。有研究表明，運動可顯著增加公豬性腺器官指數，顯著提高每次射精的精子總數[13]。長期中等強度游泳可有效激活肥胖小鼠瘦素信號通路，增加其血清睪酮水平，但長期高強度游泳反而抑制該信號通路，降低血清睪酮水平，降低精子質量[14]。這些研究中運動對于雄性動物生殖或睪酮水平的影響并不一致，原因可能與運動的時間和強度有關。本研究也發現，僅一次性力竭運動可顯著降低小鼠血清睪酮水平，損傷精子品質，而CAE 則可顯著提高小鼠血清睪酮水平，提高精子品質。目前對于高強度運動損傷雄性生殖系統的機制還不是非常清楚，推測可能與應激激素、代謝物和局部炎癥水平有關。有研究發現，高強度運動可以增加肥胖小鼠的皮質酮和乳酸的產生，從而降低睪酮的分泌，而中低強度的運動會抑制NF-κB 信號通路的激活，減少TNF-α轉錄表達，改善精子質量，提高雄性生殖能力[15]。上述結果說明，長期有氧運動對雄性動物生殖機能最為有利。所以在畜牧生產中可考慮采用長期有氧運動來改善種公豬繁殖性能。

雄性動物精子發育、成熟和品質不僅受到性腺局部組織的微環境，如睪丸組織局部炎癥、附睪液pH 等影響，也受性激素、甲狀腺素等內分泌激素影響[16]。其中，下丘腦-垂體-性腺軸對于精子發生和精子成熟過程是不可或缺的。摘除成年雄性大鼠垂體，大鼠精子發生過程受損，如補充睪酮可重新啟動精子發生過程，而且促黃體素（Luteinizing Hormone，LH）、促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone，FSH）以及睪酮的協同作用對維持正常生精和生精再激活必不可少[17]。本研究發現，不同的運動方式和運動時間對于小鼠睪酮水平有不同的影響。其中，EE 可顯著降低血清睪酮水平，而CAE 可顯著提高小鼠睪酮水平。睪酮水平受多種代謝酶影響，睪酮的生成涉及多種轉運蛋白和酶促反應，其中STAR和P450scc分別是睪酮合成過程中重要的運載體和主要的限速酶[16]。STAR轉運膽固醇至線粒體內膜，在線粒體內膜上的P450scc催化膽固醇裂解成為孕烯醇酮，后者由3β-HSD轉運至滑面內質網，經17β-HSD催化生成睪酮[18]。有研究報道，6 周間歇性游泳訓練可顯著降低大鼠睪丸STAR的mRNA 水平[19]。本研究檢測不同運動后小鼠睪丸睪酮合成代謝轉運酶相關基因發現，EE 可顯著抑制睪丸STARmRNA 表達，抑制膽固醇轉運至線粒體內膜，而CAE 可顯著上調睪丸STARmRNA 表達，增加膽固醇的轉運。由此可以推測，STAR可能是運動調節睪酮合成的關鍵靶點，而運動對睪酮合成代謝酶酶活是否有影響還需進一步研究。

睪丸生成的精子需要在附睪中完成精子成熟相應的形態變化和功能變化，包括原生質滴移位、頂體形狀和大小的變化、精子頭尾結構的固定等[19]。由此可知，附睪組織受損可導致精子畸形率的異常增加[20]。目前尚無運動如何直接通過調控附睪功能，從而影響精子成熟的研究報道。有研究表明，6 周有氧運動可增加高糖誘導肥胖小鼠附睪脫氫表雄酮的水平，同時改善大鼠的生殖功能[21]。脫氫表雄酮是作為睪酮來源的前體物質，但尚不清楚脫氫表雄酮是否介導了運動對附睪功能的調控。本研究發現，EE 嚴重損害小鼠附睪管管壁形態，精子滲出至間質，降低睪酮水平，導致精子畸形率顯著增加；而CAE 組雖對附睪形態無明顯影響，但可以顯著升高睪酮水平，同時降低了精子的畸形率。不同運動方式和運動時間通過何種機制影響附睪功能和精子成熟還有待于進一步深入研究。

4 結 論

本實驗發現，長期有氧運動可顯著促進睪酮分泌和精子生成，同時降低精子畸形率，但急性力竭運動正好相反。短期有氧運動對雄性生殖無顯著影響。