綿羊BTG2 基因CDs 區(qū)克隆、生物信息學(xué)分析及組織mRNA 表達(dá)研究

高 一 ，劉理想,2，肖 成，金海國，馬惠海，薛佳佳,2，魏 天，曹 陽*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物技術(shù)研究所，吉林公主嶺 136100；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

小尾寒羊B 細(xì)胞易位基因2（B-cell TranslocationGene 2，BTG2）是首個(gè)被鑒定的新型抗增殖因子BTG/TOB 基因家族成員[1]，位于染色體的1q32 位點(diǎn)，編碼150 個(gè)氨基酸，BGT2也被命名為TIS21、PC3，是分別表達(dá)于人類、小鼠、大鼠的同源基因[2-3]。BTG/TOB家族包括Pc3/Tis21/BTG2、Btg1、Tob、Tob2、Ana/Btg3、P c3k等，成員眾多且來自不同物種，有些命名與最初概念有一點(diǎn)不同，為便于記憶和理解，根據(jù)該家族抗增殖功能統(tǒng)一命名為APRO（Anti-Proliferative），因此BGT2又名為APRO1[4]。BTG/TOB 家族成員結(jié)構(gòu)的共同特征是蛋白分子的N-末端存在2 個(gè)約110 個(gè)高度保守氨基酸組成的同源區(qū)A box 和B box，其中A box具有抗增殖的作用，而B box 與許多靶分子結(jié)合起作用，A box 和B box 被一段非保守的氨基酸序列隔開，2 個(gè)保守區(qū)與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的CCR4 相關(guān)因子1（Caf1）有關(guān)[5]。且BTG/TOB 基因家族存在一些影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞RNA 穩(wěn)定性的ATTTA 基序[4,6]，與其他家庭成員相比，BTG1和BTG2還具有C Box[7]。BTG2在各種器官和組織中表達(dá)，如脾臟、胸腺、肺、胃和大腸，在肺、腸、胰腺和前列腺[8]，能夠阻滯細(xì)胞在G1/S 和G2/M 的過渡、增加凋亡[9]，促進(jìn)維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞分化造血細(xì)胞[10]和抑制胸腺細(xì)胞的擴(kuò)張[11]。此外，該基因具有促進(jìn)神經(jīng)元分化發(fā)育，抑制細(xì)胞增殖[9,12]，依賴p53 機(jī)制調(diào)控DNA 損傷修復(fù)[13]等生物學(xué)功能。

隨著研究深入挖掘，BTG2基因逐步成為畜牧業(yè)領(lǐng)域中研究熱點(diǎn)，并在羊中的功能研究取得一定成果。在灘羊尾部脂肪沉積的研究中發(fā)現(xiàn)，BTG2表達(dá)量與尾部脂肪沉積指標(biāo)呈正相關(guān)，能促進(jìn)脂肪沉積[14]。另有報(bào)道表明BTG2基因可以作為多脊椎小尾寒羊的候選的分子標(biāo)記或位點(diǎn)[15]。在特克賽爾（Texel）和烏珠穆沁試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BTG2對(duì)綿羊胎兒中后期骨骼肌發(fā)育有重要作用，且可能參與myostatin 調(diào)節(jié)通路[16]。本實(shí)驗(yàn)擬克隆小尾寒羊BTG2基因CDs 區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)檢測(cè)該基因在羔羊期不同組織中的mRNA表達(dá)情況，旨在為進(jìn)一步探索BTG2基因在羔羊期的生理學(xué)作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料采集 3 日齡和40 日齡的小尾寒羊心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、十二指腸、背最長(zhǎng)肌組織，存于凍存管中，液氮保存。

1.2 主要試劑 Trizol 購自Invitrogen 公司；2xEs Taq Master Mix（dye）購自康為世紀(jì)；DNA Marker2000bp、PrimeScriptRTTMreagent Kit with gDNA Eraser、SYBR?Premix Ex taqTM、pMD18-T 載體購自TaKaRa 公司；Gel Extraction Kit 購自O(shè)MEGA 公司。引物、測(cè)序均由金唯智生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫中綿羊BTG2基因CDs 序列，使用Primer Premier5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物及定量引物（表1），選取β-actin為內(nèi)參基因。

1.4BTG2基因CDs 區(qū)克隆 提取綿羊肌肉組織RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR 擴(kuò)增體系：2×Master Mix 10 μL，1 μmol/L F-primer 0.4 μL，1 μmol/L R-primer 0.4 μL，50 ng/μL cDNA 1.2 μL，補(bǔ)充ddH2O 至20 μL。擴(kuò)增程序：98℃ 5min；98℃ 10 s；61℃ 30 s；72℃30s，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

PCR 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)并進(jìn)行膠回收。采用TA 克隆的方法，將回收產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃孵育30min 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨后涂布在氨芐青霉素平板上，于37℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，挑取單克隆菌落于含有氨芐的液體培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min 搖床震蕩過夜。最后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，并送往蘇州金唯智生物公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析 將綿羊BTG2基因序列在NCBI中BLAST 比對(duì)同源性，利用MEGA-X 軟件構(gòu)建綿羊、牛、豬、人、大鼠、小鼠、虎鯨系統(tǒng)進(jìn)化樹；根據(jù)在線軟件http://www.bio-soft.net/sms/prot_mw.html 分析蛋白分子量；https://web.expasy.org/protparam/ 分析蛋白的基本理化性質(zhì)；https://web.expasy.org/protscale/ 分析蛋白氨基酸序列的親疏水性；http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/預(yù)測(cè)氨基酸序列信號(hào)肽；TMHMM-2.0分析蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)；http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ 和https://psort.hgc.jp/form2.html 預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.p 和http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/phyre2_output/分析蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.6BTG2基因在綿羊各組織中的表達(dá)分析 提取3 日齡和40 日齡綿羊各組織RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qPCR 檢測(cè)BTG2基因在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、腸、肌肉中的mRNA 表達(dá)量。PCR 擴(kuò)增體系：SYBR?Premix Ex taqTM10 μL，cDNA 1.5 μL，F(xiàn)-primer 0.4 μL，R-primer 0.4 μL，補(bǔ)充ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)程序：95℃5 min；95℃ 10 s；60℃15 s，72℃ 20 s，共40 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。熔解曲線分析：95℃ 5 s；65℃ 1 min，每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔct方法分析相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列信息

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1BTG2基因CDs 區(qū)序列克隆 以肌肉組織cDNA為模板，PCR 擴(kuò)增得到一條453 bp 的特異性片段（圖1），與預(yù)期長(zhǎng)度相符。同時(shí)用TA 克隆的方法，測(cè)序比對(duì)序列正確，表明本實(shí)驗(yàn)成功克隆出綿羊BTG2基因 CDs 區(qū)。

2.2BTG2基因序列的生物信息學(xué)分析。

圖1 BTG2 瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2.1 同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 通過NCBI 中BLAST 對(duì)綿羊BTG2基因CDs（NM_001246210.1）核苷酸序列與牛（XM_002693879.5）、豬（XM_018059998.1）、人（NM_006763.3）、大鼠（NM_017259.1）、小鼠（NM_007570.2）、虎鯨（XM_004282488.2）進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果顯示綿羊與牛、豬、虎鯨、人、大鼠、小鼠同源性分別為98.9%、90.29%、94.04%、88.52%和85.65%、86.98%，說明該基因在生物進(jìn)化過程中比較保守。利用MEGA-X 軟件鄰近法（Neighbor-Joining Method，NJ）構(gòu)建核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹模型，發(fā)現(xiàn)物種進(jìn)化過程中綿羊與牛的親緣關(guān)系最近，與小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖2）。

圖2 BTG2 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2.2 綿羊BTG2 蛋白理化性質(zhì) 利用在線ProtParam軟件分析BTG2 蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示BTG2基因編碼150 個(gè)氨基酸，根據(jù)氨基酸殘基組成表（表2）可知含量最高的是亮氨酸（11.3%），不含吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸。蛋白的分子式C748H1190N208O213S8，分子質(zhì)量為17 ku，理論等電點(diǎn)（pI）為9.14，肽鏈N 端為蛋氨酸（Met），半衰期為30 h。其水溶液在280 nm 處的消光系數(shù)為21680，不穩(wěn)定系數(shù)為48.51，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為94.27，親水性總平均值為-0.123。根據(jù)ProtScale 在線軟件對(duì)蛋白做進(jìn)一步的疏水性分析（圖3），其中縱坐標(biāo)0 值以上為疏水區(qū)，分值越高疏水性越強(qiáng)，0 值以下為親水區(qū)，分值越低親水性越強(qiáng)。由圖3 可知，多肽鏈的第9 位氨基酸分值最高為2.167，第47 位氨基酸分值最低為-2.111。該氨基酸序列親水性殘基多于疏水性殘基，因此整體表現(xiàn)為親水性，與ProtParam 軟件預(yù)測(cè)蛋白親水性結(jié)果相同。

表2 BTG2 蛋白氨基酸組成

圖3 BTG2 蛋白親疏水性分析

2.2.3 綿羊BTG2 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)及信號(hào)肽分析 TMHMM在線軟件對(duì)BTG2 蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示1～150 的氨基酸都位于膜外，不存在跨膜結(jié)構(gòu)。在線軟件SignalP 對(duì)BTG2 蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明該蛋白不存在信號(hào)肽序列，也就說明該蛋白不是分泌型蛋白。

2.2.4 綿羊BTG2 蛋白亞細(xì)胞定位 使用TargetP、PSORT II 分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位（表3），分析顯示BTG2 存在于分泌信號(hào)通路位點(diǎn)（mTP）、線粒體作用位點(diǎn)（SP），所占比例均很小。蛋白主要分布于細(xì)胞核，線粒體上、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞壁、分泌系統(tǒng)的囊泡、細(xì)胞支架中也有分布。

表3 綿羊BTG2 蛋白亞細(xì)胞定位

2.2.5 BTG2 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 運(yùn)用SOPM 軟件預(yù)測(cè)BTG2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α-螺旋、β折疊股（β股）、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占36%、20%、4.67%和39.33%。利用psipred 軟件再次預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），結(jié)果與SOPM 預(yù)測(cè)相一致，顯示蛋白結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋（Helix）、無規(guī)則卷曲（Coil）)和β股（Strand）構(gòu)成，為混合型蛋白。Phyre2 在線軟件對(duì)BTG2 的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5），其主要構(gòu)成仍為α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β股，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基本一致。并用JSmol 軟件進(jìn)行查看，其結(jié)果與模板序列可信度（confidence）100%，模型精度（identify）92%。

圖4 BTG2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 BTG2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 BTG2 基因在綿羊不同組織中的表達(dá)

2.3BTG2基因在不同日齡不同組織間的表達(dá)分析qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果如圖6 所示，以BTG2 在3 日齡的心臟表達(dá)量作參照組，BTG2基因在各組織（心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腸和肌肉）中均有表達(dá)，且無論在3 日齡還是40 日齡階段都以肝臟中表達(dá)量最高（P＜0.001）；經(jīng)數(shù)據(jù)分析，在心、肝、脾、肺組織中，40 日齡BTG2 表達(dá)量極顯著高于3 日齡，而在腎臟、腸和肌肉中，40 日齡極顯著低于3 日齡。也就是說在3日齡至40 日齡階段，隨著日齡增長(zhǎng)，BTG2基因在心、肝、脾、肺組織中表達(dá)量增加，在腎臟、腸和肌肉中表達(dá)趨勢(shì)降低。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)綿羊BTG2基因核苷酸序列與其他幾個(gè)物種進(jìn)行同源性比對(duì)，比對(duì)結(jié)果與系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果保持一致，顯示綿羊與牛的親緣關(guān)系最近，與小鼠的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，證實(shí)了BTG2序列在物種間具有高度保守性，符合生物進(jìn)化的特征，且具有廣泛的同源性。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征是疏水/親水間的平衡，其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定在很大程度上有賴于分子內(nèi)的疏水作用，軟件分析該氨基酸序列親水性殘基多于疏水性殘基，表現(xiàn)為親水性，也進(jìn)一步說明BTG2屬于不穩(wěn)定蛋白。BTG2 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示不存在跨膜結(jié)構(gòu)，且1～150 的氨基酸都位于膜外，與蛋白的親水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致。對(duì)其進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)BTG2 蛋白氨基酸序列不存在信號(hào)肽，意味著不能夠?qū)⑿潞铣傻牡鞍踪|(zhì)引導(dǎo)向分泌通路，不屬于分泌蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，該蛋白主要分布于細(xì)胞核和線粒體上，鑒于2 個(gè)細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮的重要功能，提示BTG2 蛋白可能通過接受外來信號(hào)參與細(xì)胞的遺傳代謝、細(xì)胞周期、凋亡和分化等過程。根據(jù)目前已有的BTG2研究來看，可以肯定的是BTG2確實(shí)參與細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控、抑制細(xì)胞增殖、DNA 損傷修復(fù)及腫瘤抑制等過程。該基因蛋白二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果相一致，顯示以α-螺旋、無規(guī)則卷曲為主。

BTG2基因在不同日齡羔羊組織中qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，該基因在各組織中廣泛分布。存在于心臟、肺臟、腎臟中，說明其參與呼吸和泌尿的可能性；表達(dá)在肝臟和肌肉中，提示其可能參與脂類代謝、糖代謝等調(diào)控過程；在腸中表達(dá)，說明其可能在機(jī)體消化、促生長(zhǎng)方面具有重要作用；在脾臟中表達(dá)，推測(cè)其與免疫功能有關(guān)。數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BTG2在各組織中表達(dá)存在差異，但以在肝臟中表達(dá)量最高，表示BTG2可能與脂代謝、糖代謝等過程密切相關(guān)。關(guān)于BTG2的研究中，有研究人員發(fā)現(xiàn)包括BTG2在內(nèi)的6 個(gè)基因（BTG2、PDHB、SORBS1、TRDN、TTN和MGP）在肌間脂肪含量不同的日本和牛中存在差異表達(dá)[17]。此外，有研究表明BTG2能夠通過Stat3 信號(hào)通路的來抑制前脂肪生成活性，在前脂肪細(xì)胞分化過程中，呈現(xiàn)波動(dòng)表達(dá)趨勢(shì)[18]。在灘羊尾部脂肪沉積的探索試驗(yàn)結(jié)果表明，BTG2表達(dá)量則對(duì)尾部脂肪沉積指標(biāo)呈正相關(guān)，能促進(jìn)脂肪沉積[14]。并有報(bào)道證明，經(jīng)cAMP 信號(hào)通路，BTG2與肝糖生成相關(guān)基因協(xié)同上調(diào)，可致肝糖含量增加[6]。這些研究結(jié)果提示BTG2基因與脂代謝、脂肪沉積乃至碳水化合物的積累存在緊密關(guān)聯(lián)。對(duì)數(shù)據(jù)深入分析發(fā)現(xiàn)，在3～40 日齡階段，隨著日齡增長(zhǎng)，BTG2基因在心、肝、脾、肺組織中表達(dá)量增加，但在腎臟、腸和肌肉中表達(dá)量降低。本研究推測(cè)BTG2于不同時(shí)間段在各組織中發(fā)揮的作用不同，所以表達(dá)趨勢(shì)有所變化，但具體功能作用和機(jī)制仍不清楚，有待后續(xù)進(jìn)一步的細(xì)化研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)成功克隆BTG2基因蛋白編碼區(qū)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示小尾寒羊BTG2基因CDs區(qū)長(zhǎng)度453 bp，分子質(zhì)量為17ku 的親水性的不穩(wěn)定蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽，蛋白主要分布于細(xì)胞核，存在于分泌信號(hào)通路位點(diǎn)，高級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β股構(gòu)成，并在在生物進(jìn)化過程具有保守性。通過對(duì)該基因的3 日齡和40 日齡的羔羊期組織表達(dá)圖譜分析，BTG2在在各組織中的廣泛分布且表達(dá)趨勢(shì)不同，以肝臟中表達(dá)量最高，且隨著日齡增長(zhǎng)，該基因在心、肝、脾、肺組織中表達(dá)量增加，在腎臟、腸和肌肉中表達(dá)量降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持BTG2與脂代謝相關(guān)這一觀點(diǎn)，但還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來提供支持和驗(yàn)證。