中國荷斯坦牛PIN1 基因對產奶性狀的遺傳效應分析

林 珊 ，楊宇澤，劉 林，李艷華，韓 博，許令娜，張俊楠，麻 柱，張勝利，孫東曉*

（1.中國農業大學動物科學技術學院，北京 100193；2.北京市畜牧總站，北京 100107；3.北京奶牛中心，北京 100192）

產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率是奶牛的主要生產性狀，屬于數量性狀，由微效多基因控制[1]。與傳統的以表型數據為基礎的遺傳評估相比，標記輔助選擇可以利用DNA 水平的分子信息，從而獲得更快的遺傳進展。Meuwissen 于2001 年第一次提出基因組選擇（Genomic Selection，GS）[2]。自2009 年始，美國、加拿大等奶業發達國家陸續將GS 技術應用于奶牛育種[3-5]，我國從2012 年開始在全國范圍內開展荷斯坦青年公牛基因組遺傳評估工作[6-7]。基因組選擇可實現青年公牛的早期選擇，極大縮短世代間隔，加快遺傳進展，節約育種成本[2,8]。Zhang 等[9]研究表明，在基因組選擇所用的全基因組SNP 芯片中加入遺傳效應較大的基因信息可提高基因組育種值估計準確性。因此，鑒定奶牛重要性狀功能基因具有重要意義。

作者前期對8 頭來自同胞或半同胞家系的極端高低乳脂乳蛋白率的荷斯坦公牛進行了全基因組重測序，通過生物信息學分析鑒定到17 個產奶性狀候選功能基因[10]。其中，肽基脯氨酸順反異構酶基因（Peptidylprolylcis/transisomerasesNIMA-interacting1，PIN1）參與乳脂、乳蛋白合成代謝相關通路，包括甘油三酯代謝、甘油磷脂代謝以及mTOR 信號通路，且位于產奶量和乳蛋白量性狀的QTL 顯著區間[11]。牛PIN1基因定位于7 號染色體上，全長12 255 bp（ARS-UCD1.2），編碼肽基脯氨酸順反異構酶，能夠特異性催化磷酸化的絲/蘇氨酸-脯氨酸基序[12]，可參與調控細胞增殖及凋亡[13]、乳腺細胞增殖[14]、乳脂和乳脂蛋白相關通路PI3K/AKT/β-catenin 中多個關鍵蛋白的調控[15]。本研究以PIN1基因為研究對象，基于北京地區中國荷斯坦牛群體，進一步研究其多態性及其對產奶性狀的遺傳效應，以期為中國荷斯坦牛的分子標記輔助選擇提供基因信息。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究以北京首農畜牧綠荷牛業的40個公牛家系的987 頭中國荷斯坦母牛為實驗群體，牛只具有完整的系譜信息和規范的 DHI（Dairy Herd Improvement）測定記錄，包括第1 泌乳期記錄947 條和第2 泌乳期記錄655 條，描述性統計量見表1 和表2。表型數據包括產奶量、乳脂率、乳脂量、乳蛋白率和乳蛋白量5 個性狀，均由北京奶牛中心提供。

表1 中國荷斯坦牛試驗群體的第1 泌乳期5 個產奶性狀表型值描述性統計

表2 中國荷斯坦牛試驗群體的第2 泌乳期5 個產奶性狀表型值描述性統計

1.2 基因組DNA 的提取 中國荷斯坦母牛的基因組DNA 提取采用血液基因組 DNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）40 頭公牛的凍精基因組提取采用優化的高鹽法進行提取[16]。提取后DNA 采用 NannoDrop2000 分光光度計（Thermo Scientific，Hudson，DE，美國）和1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度和純度，合格的DNA 置于1.5 mL 離心管，-20℃保存備用。

1.3 候選基因的多態性檢測 根據GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）中牛PIN1基因（GenBankNo.AC_000165.1）的全部編碼區以及上下游調控區2 000 bp，利用Primer5.0 設計9 對引物，擴增片段長度為471～839 bp（表3）。利用NanoDrop2000 分光光度計（ThermoScientific，Hudson，DE，美國）分別測定40頭公牛基因組DNA 的濃度并將其稀釋為50 ng/μL，吸取1μL 混池后PCR 擴增測序以檢測基因的多態性。PCR反應體系為25μL：10 pmol/μL 上、下游引物各1.25 μL，2× Taq Master Mix 12.5 μL，混池基因組DNA（50～100 ng/μL）2 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反應條件為：94℃5min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；最后72 ℃延伸7 min。PCR 反應產物以1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將PCR 擴增產物送華大基因有限公司進行雙向測序。基于測序結果，利用Chromas 和DNAMan6.0 軟件鑒定多態位點及突變類型。利用靶向測序基因型（Genotyping By Target Sequencing，GBTS）技術對987 個個體進行SNP 基因型檢測。

1.4 關聯分析 本研究采用 SAS 9.2 軟件中的 MIXED過程對實驗群體的中國荷斯坦母牛產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率5 個產奶性狀和SNP 位點基因型進行關聯分析，共利用2 827 頭牛個體信息，采用動物模型如下：

Y=μ+hys+b×M+G+a+e

其中，y 為個體產奶性狀（產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）表型值，μ 為總體均值，hys 為場年季效應，b 為協變量 M 的回歸系數，M 為產犢月齡效應，G 為基因型，a 為個體隨機加性效應，e 為隨機殘差效應。多重比較采用Bonferroni 法進行矯正。

加性效應、顯性效應和替代效應的計算公式如下：

a=（AA-BB）/2；d=AB-（AA+BB）/2；α=a+d（q-p）

其中，a 為加性效應，d 為顯性效應，α 為等位基因替代效應；AA、AB、BB 為相應基因型產奶性狀最小二乘均值。

表3 用于PNI1 基因混池測序的9 對PCR 擴增引物序列信息

1.5 組織表達譜分析 為進一步檢測PIN1基因的潛在功能，本研究進行了組織表達譜分析，包括乳腺、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴和胃。選擇3 頭泌乳期荷斯坦母牛，采集3 頭牛的8 種組織，液氮保存待用。利用Trizol 試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，美國）提取每頭母牛每個組織的總RNA，使用NanoDrop 2000 分光光度計（Thermo Scientific，Hudson，DE，美國）和1.0% 凝膠電泳檢測RNA 的濃度和質量。利用PrimerScriptH RT 試劑盒（TaKaRa 生物技術有限公司，大連）進行反轉錄。根據NCBI 網站PIN1的cDNA 序列（NM_001034632.3）設計跨內含子引物，PCR 產物長度為252 bp，上、下游引物序列分別為：CATCACTAATGCCAGCCAGT 和CTGAACTGTGAGG CCAGAGA。

采用羅氏熒光定量PCR 儀（Roche，Penzberg，德國）檢測PIN1基因的mRNA 相對表達量，反應體積為15 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物（10 mmol/L）各0.375 μL，蒸餾水4.75 μL，SYBR Green 混合物7.5 μL。PCR 條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 10 s，45 個循環，最后72℃延伸7 min。定量PCR 使用3 個生物學重復和3 個技術重復，以GAPDH（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase）基因為內參，用2-ΔΔCt方法對基因相對表達進行標準化[17]。

2 結果

2.1PIN1基因多態性鑒定結果 以40 頭公牛的基因組混池DNA 為模板，利用9 對引物對PIN1基因分段PCR 擴增并進行PCR 產物直接測序，結果在內含子2鑒定到1 個G/A 突變，命名為 g.14432394G＞A（圖1）。SNP 位點的等位基因G、A 的頻率分別為0.479 7 和0.520 3，基因型AA、AG 和GG 的頻率分別為0.233 0、0.493 4 和0.273 6。卡方檢驗結果顯示，該SNP 位點處于Hardy-Weinberg 平衡狀態（P=0.716 8，表4）。

圖1 中國荷斯坦牛PIN1 基因的SNP 位點測序結果

2.2PIN1基因與產奶性狀的關聯分析結果 SNP 位點g.14432394G＞A 與5 個產奶性狀（產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率）的關聯分析結果見表5。在第1 泌乳期，g.14432394G＞A 與產奶量、乳脂量乳、蛋白量和乳蛋白率均達到顯著（P=0.049 3）或極顯著關聯（P=0.000 1～0.001 9），與乳脂率關聯不顯著（P=0.616 9）；第2 泌乳期，SNP 位點g.14432394G＞A 與產奶量、乳脂率、乳脂量和乳蛋白率達到顯著或極顯著關聯（P=0.000 1～0.010 4），與乳蛋白率關聯不顯著（P=0.369 9）。

PIN1基因等位基因加性效應、顯性效應和替代效應檢驗結果見表6。SNP 位點 7:g.14432394G＞A 對產奶量、乳脂量和乳蛋白量的加性效應或等位基因替代效應在第1 和第2 泌乳期均達到顯著或極顯著，而乳蛋白率僅在第1 泌乳期達到顯著。即每個A 等位基因替代C等位基因會導致產奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率的減少。該位點對乳脂率的加性效應或等位基因替代效應在第1 和第2 泌乳期均不顯著。

表4 PNI1 基因SNP 位點7:g.14432394G＞A 的等位基因頻率、基因型頻率及哈代-溫伯格平衡檢驗

表5 PNI1 基因SNP 位點7:g.14432394G＞A 與5 個產奶性狀的遺傳關聯分析（最小二乘均值±標準誤）

表6 PIN1 基因7:g.14432394G＞A 位點等位基因加性效應、顯性效應和替代效應檢驗

2.3 組織表達譜分析結果

2.3.1 總RNA 提取結果 利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測3 頭泌乳期荷斯坦母牛8 種組織的總RNA，結果顯示每個泳道均有3 條清晰條帶，基本無降解（圖2），OD260/280均在2.0 左右，OD260/230均在2.0 以上，RNA濃度1 000 ng/μL 左右，符合下一步實驗要求。

PIN1 的cDNA 序列PCR 擴增產物1.5% 瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PIN1基因的PCR 產物條帶明亮清晰且單一可用于后續熒光定量實驗（圖3）。

2.3.2 組織表達譜分析結果 通過熒光定量PCR 擴增，PIN1基因的mRNA 在乳腺、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴和胃的相對表達量如圖4 所示。結果顯示，PIN1基因在乳腺和肝臟組織中表達量相對較高，表明PIN1可能參與了乳成分的合成。

3 討 論

圖2 荷斯坦牛不同組織中總RNA 的電泳檢測結果

圖3 PIN1 基因cDNA 的PCR 擴增檢測結果

圖4 PIN1 基因在泌乳荷斯坦牛8 種組織中的表達量分析

作者前期對極端高低乳脂乳蛋白率中國荷斯坦公牛全基因組重測序的研究鑒定PIN1為影響奶牛乳成分性狀的候選功能基因[10]。本研究對PIN1基因進行深入遺傳效應分析，結果證明該基因對中國荷斯坦牛產奶量、乳蛋白和乳脂性狀確有顯著影響。

3.1 內含子突變對基因調控作用的影響 前人對基因多態性的研究多集中在編碼區和5′翼區，而忽略了對內含子多態性的研究。近年來，已有研究表明內含子具有調控功能。在玉米上，內含子可以增加細胞ADH1 和CAT 的表達[18]。在人上，SLC2A9基因內含子7 中的1 個SNP（rs734553）與血清尿酸和慢性腎臟疾病的進展密切相關[19]。在奶牛上，ECHS1基因的6 個內含子SNPs 與牛奶脂肪酸顯著關聯[20]。因此，本研究所發現的PIN1內含子SNP 可能對產奶性狀有潛在調控功能。

3.2PIN1基因與產奶性狀相關功能分析PIN1基因參與蛋白質分解代謝過程的負調控、甘油三酯和甘油磷脂代謝以及mTOR 信號通路，位于產奶量、乳蛋白率、乳蛋白量QTLs 區間內[21-23]。研究表明，PIN1在促進脂質堆積和炎癥伴隨的纖維化變化的惡化中起關鍵作用[24]。PIN1的靶蛋白胰島素受體底物1（IRS-1）、AMP 激活的蛋白激酶（AMPK）和乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）均參與脂質積累的過程[24]。本研究中，PIN1在乳腺組中高表達，而在人癌癥研究中發現PIN1在乳腺癌患者乳腺中表達量明顯上升，表明PIN1可能與乳腺細胞增殖相關[14]。在體內異種移植腫瘤模型中，PIN1過表達會導致PI3K、AKT 和β-catenin 通路中多個關鍵蛋白的下調[15]。其中，PI3K 和β-catenin 是與乳脂乳蛋白合成代謝相關的通路，可見PIN1對乳汁合成分泌過程有重要作用。

從關聯分析結果可以看出，PIN1基因SNP 位點7:g.14432394G＞A 與產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率均呈顯著或極顯著關聯，同時該位點對產奶量、乳脂量、乳蛋白量和乳蛋白率性狀的加性效應和等位基因替代效應顯著，說明不同基因型個體間的差異是可以遺傳的，能將其應用于奶牛育種工作。通過傳統的育種方法來進行優質高產奶牛的選育是一件長期而艱巨的工作，而在奶牛基因組選擇中加入與產奶性狀相關的基因，可以更準確、更早地進行選育工作，從而降低生產成本，加快遺傳進展[9,25]。

4 結 論

作者前期的重測序研究將PIN1基因鑒定為奶牛產奶性狀候選功能基因，本研究進一步證明，PIN1與奶牛產奶性狀有顯著關聯。PIN1基因SNP 位點7:g.14432394G＞A 與產奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量和乳蛋白率均呈顯著或極顯著關聯，且加性效應和等位基因替代效應顯著。可根據育種目標將PIN1基因及SNP 位點7:g.14432394G＞A 作為遺傳標記為中國荷斯坦牛的分子育種提供有價值的基因信息。