馬齒莧多糖雙酶法提取工藝優化及其抗氧化性研究

楊電增，鄒蘭蘭，錢志偉

（河南農業職業學院，河南 鄭州 451450）

馬齒莧（Portulaca oleraceaL.）又名五行草、麻繩菜、長命菜，為馬齒莧科馬齒莧樹屬1 年生野生肉質草本植物，在我國資源儲備極其豐富，被衛生部列入既是食品又是藥品的物品名單目錄[1]。據文獻報道，馬齒莧中含有豐富的多糖、黃酮類、生物堿類、香豆素類、萜類、有機酸類物質等多種生物活性成分。馬齒莧多糖（Portulaca oleraceapolysaccharides）是其主要活性成分之一，由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、木糖和阿拉伯糖組成[2]，具有抑菌、抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化、降血糖、調血脂、抗衰老、保護心血管等生理功能[3-10]。因此，有效提取馬齒莧多糖對馬齒莧的綜合利用具有重要意義。

目前報道的馬齒莧多糖的提取工藝主要有溶劑提取、超聲波提取、微波提取、酶水解、高壓脈沖提取以及超高壓提取等方法[11-15]。而就酶法提取來說，其關鍵是依靠果膠酶及纖維素酶對植物的細胞壁和細胞間質中的果膠還有纖維素等物質進行水解，進一步提高活性成分的溶解速度，同時增強其溶解的效率。陳凌等[1]和錢志偉等[16]分別對果膠酶和纖維素酶提取馬齒莧多糖工藝進行了優化，然而，雙酶法在馬齒莧多糖提取中的研究還未見報道。

因此，本研究以馬齒莧為原料，使用苯酚-硫酸法測定多糖含量，探究纖維素酶和果膠酶的加入量、酶解溫度、酶解時間以及液料比對多糖得率的影響，在此基礎上采用正交試驗優化雙酶法提取馬齒莧多糖的最佳工藝參數，并測定其體外抗氧化活性，為馬齒莧資源的高效利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

馬齒莧（盛花期），于2020 年7 月下旬采摘于河南省農業高新科技園。置于60 ℃恒溫箱烘24 h，破壁機粉碎后過60 目篩，加入乙醚進行脫脂處理，備用。

1,1-二苯基-2-苦肼基（DPPH,純度99%），美國Sigma-Aldrich 公司產品；果膠酶（60 000 U/g）、纖維素酶（50 000 U/g），浙江一諾生物科技有限公司產品；雙氧水、硫酸亞鐵等為分析純，國藥集團產品。

1.1.2 儀器與設備

UV1901PCS 型雙光束紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；D5-R2 型離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；RE2000 型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；BSA423S-CW 型分析天平，德國賽多利斯集團；HH-2 型數顯恒溫水浴鍋，上海喬躍電子科技有限公司；L18-YJ08 型靜音真空破壁機，杭州生活電器有限公司；WGL-230B 型電熱恒溫鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧多糖的雙酶法提取

準確稱取馬齒莧粉末2.000 0 g，放入錐形瓶中，加入20 mL 超純水，加入纖維素酶和果膠酶，并在pH 5.0條件下進行酶水解，酶水解后按一定料液比加入超純水，最后于75 ℃的水浴中提取4 h。將提取液以4 000 r/min 的速度離心15 min，取上清液進行減壓蒸餾，最終用超純水定容至50 mL。

1.2.2 單因素試驗設計

1.2.2.1 纖維素酶添加量的篩選

選擇果膠酶添加量1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解時間120 min，液料比25∶1（mL/g），設置相對馬齒莧質量的纖維素酶添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，考察纖維素酶添加量對馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.2 果膠酶添加量的篩選

選擇纖維素酶添加量2.0%，酶解溫度45 ℃，酶解時間120 min，液料比25∶1（mL/g），設置相對馬齒莧質量的果膠酶添加量分別為0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%，考察果膠酶添加量對馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.3 酶解時間的篩選

選擇相對馬齒莧質量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解溫度45 ℃，液料比25∶1（mL/g），設置酶解時間分別為20、40、60、80、100、120 min，考察酶解時間對馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.4 酶解溫度的篩選

選擇相對馬齒莧質量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解時間120 min，液料比25∶1（mL/g），設置酶解溫度分別為25、30、35、40、45、50、55、60 ℃，考察酶解溫度對馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.2.5 液料比的篩選

選擇相對馬齒莧質量的纖維素酶和果膠酶添加量分別為2.0%、1.2%，酶解溫度45 ℃，酶解時間120 min，設置液料比分別為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g），考察液料比對馬齒莧多糖得率的影響。

1.2.3 正交試驗設計

依據單因素試驗結果，選擇纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間和酶解溫度為主要影響因素，以馬齒莧多糖得率為考察指標，進行L9（34）正交試驗，考察各因素對馬齒莧多糖得率的影響，正交試驗因素水平見表1。

1.2.4 馬齒莧多糖得率的測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制

精密稱取20 mg 干燥至恒重的葡萄糖，用超純水溶解定容至100 mL，并對其進行搖勻，配成0.2 mg/mL的多糖儲備液，置于低溫冰箱中保存（4 ℃）以備用。準確吸取一定量標準品儲備溶液，并將其配制成質量分數分別為0、6.0、18.0、30.0、42.0、54.0 μg/mL 葡萄糖標準溶液。分別精確吸取2.0 mL 系列標準溶液于比色管中，各加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，充分混勻后置于沸水浴中顯色20 min，之后將其取出，然后置于冷水中冷卻10 min。待冷卻后取出，再靜置10 min。采用紫外分光光度計在490 nm 處其對吸光度進行測定[17]。將葡萄糖標準溶液濃度（μg/mL）作為自變量（x），將吸光度A作為因變量（y）進行線性回歸分析，得到葡萄糖標準曲線回歸方程為：y=0.016 3x+0.017 9，R2=0.998 6。葡萄糖標準品濃度處于0～54.0 μg/mL 時與吸光度存在較強的效應關系。

1.2.4.2 馬齒莧多糖得率

準確稱取5 份5.000 0 g 馬齒莧粉，按正交試驗得出的最佳提取工藝，提取液以6 000 r/min 的速度離心20 min，旋轉蒸發濃縮后定容至50 mL。取馬齒莧多糖提取液2 mL，依據“1.2.4.1”中的相關操作，測定其吸光度，馬齒莧多糖得率的計算公式為：

馬齒莧多糖得率（mg/g）=多糖質量（mg）/馬齒莧粉末質量（g）

1.2.5 馬齒莧多糖體外抗氧化活性的測定

1.2.5.1 DPPH·清除率的測定

分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液0.2 mL 置于試管中，加入80 mg/L DPPH·無水乙醇溶液3.8 mL，搖勻，室溫條件下于黑暗處放置30 min。在波長517 nm 處分別測定吸光度Ai，另分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液0.1 mL 置于試管，加入3.9 mL 無水乙醇，在波長517 nm 處分別測定參比吸光度Ab；再取0.1 mL 無水乙醇，加入80 mg/L 的DPPH·無水乙醇溶液3.9 mL，在波長517 nm 處測定空白吸光度A0[18]。DPPH·清除率計算公式為：

1.2.5.2 OH·清除率的測定

分別取不同濃度馬齒莧多糖提取液及VC 溶液2 mL 置于試管中，加入6 mmol/L FeSO4溶液2 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液2 mL，搖勻，靜置10 min 后，加入6 mmol/L 水楊酸溶液2 mL，搖勻，靜置30 min。在波長510 nm 處分別測定其吸光度Ai；另用蒸餾水代替水楊酸溶液重復上述試驗，測得參比吸光度Ab；另用蒸餾水代替樣品溶液重復上述試驗，測得空白吸光度A0[19]。OH·清除率計算公式為：

1.2.6 數據處理

所有數據均平行測定3 次，采用Excel 2016 和Origin 9.0 對試驗數據進行處理和分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量對馬齒莧多糖得率的影響

由圖1 可以看出，纖維素酶添加量0～2.5%時，馬齒莧多糖得率呈現出先升高后降低的趨勢。纖維素酶添加量為1.5%時，多糖得率達到最高，為18.62 mg/g；纖維素酶添加量增至2.0%時，馬齒莧多糖得率略有降低，但與添加量1.5%組無顯著差異；纖維素酶添加量增至2.5%時，馬齒莧多糖得率繼續降低。原因可能是纖維素酶濃度達到一定值后，底物濃度相對不能飽和，導致酶的作用受阻[20]。同時，結果表明雙酶法提取馬齒莧多糖得率顯著高于單一果膠酶提取法（纖維素酶添加量0 時）得率（P＜0.05）。故選擇纖維素酶添加量1.0%～2.0%用于進一步優化試驗。

圖1 纖維素酶添加量對多糖得率的影響Fig.1 Effects of cellulose additions on the yield of polysaccharides

2.2 果膠酶添加量對馬齒莧多糖得率的影響

由圖2 可知，馬齒莧多糖得率隨著果膠酶添加量的增加呈現出先升高后平穩的趨勢。當果膠酶添加量為1.6%時，馬齒莧多糖得率達到最高，為19.09 mg/g；果膠酶添加量增至2.0%時，馬齒莧多糖得率略有降低，但與1.6%添加量組無顯著差異。可能是由于果膠酶濃度達到一定值后，底物濃度相對不能飽和，導致酶作用受阻。同時，結果表明雙酶法提取馬齒莧多糖得率顯著高于單一纖維素酶（果膠酶添加量0 時）提取法得率（P＜0.05）。故選擇果膠酶添加量1.2%～2.0%用于進一步優化試驗。

圖2 果膠酶添加量對多糖得率的影響Fig.2 Effects of pectinase additions on the yield of polysaccharides

2.3 酶解時間對馬齒莧多糖得率的影響

由圖3 可以看出，提取獲得的馬齒莧多糖得率隨著時間的延長而升高，到100 min 時升高到較高水平，為18.85 mg/g；酶解時間延長至120 min 時，馬齒莧多糖得率略有升高，但與100 min 樣品組無顯著差異。故選擇酶解時間80～120 min 用于進一步優化試驗。

圖3 酶解時間對多糖得率的影響Fig.3 Effects of enzymolysis time on the yield of polysaccharides

2.4 酶解溫度對馬齒莧多糖得率的影響

由圖4 可以看出，在試驗設計的溫度范圍內，馬齒莧多糖得率先隨著酶解溫度的持續上升而升高，當溫度升至50 ℃時，馬齒莧多糖得率達到最大，為19.40 mg/g，而當溫度繼續升高超過50 ℃，多糖得率反而下降，55 ℃和60 ℃樣品組與50 ℃樣品組相比均存在顯著差異（P＜0.05）。可能是由于溫度過高導致酶活性衰減，而使酶解反應難以充分進行，導致多糖得率下降。故選擇酶解溫度45～55 ℃用于進一步優化試驗。

2.5 液料比對馬齒莧多糖得率的影響

由圖5 可以看出，馬齒莧多糖得率隨著液料比的增加而升高，而當液料比達到25∶1（mL/g）時，多糖得率最大，為19.24 mg/g。增加提取溶劑添加量可使多糖與溶劑的接觸面增大，從而促使多糖溶出。而液料比25∶1～35∶1（mL/g）時，多糖得率波動幅度相對不大，與25∶1（mL/g）樣品組無顯著差異。從經濟性角度考慮，選擇液料比25∶1（mL/g）進行后續試驗。

圖4 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.4 Effects of enzymolysis temperatures on the yield of polysaccharides

圖5 液料比對多糖得率的影響Fig.5 Effects of liquid-solid ratios on the yield of polysaccharides

表2 馬齒莧多糖提取的正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results of Portulaca oleracea polysaccharides

2.6 馬齒莧多糖提取的正交試驗

由表2 可知，試驗中各因素對馬齒莧多糖得率影響的主次順序為：D＞B＞C＞A，即酶解溫度的影響最大，果膠酶添加量和酶解時間次之，纖維素酶添加量的影響最小。對馬齒莧多糖進行提取的最優組合為：A2B3C2D2，即纖維素酶添加量1.5%，果膠酶添加量2.0%，酶解時間100 min，酶解溫度50 ℃。為確定最佳提取工藝條件的穩定性和可靠性，按照此條件做驗證試驗，重復3 次，得到的馬齒莧多糖得率為(19.83±0.41)mg/g，高于正交試驗中的所有試驗結果，說明該工藝條件穩定可靠。

2.7 馬齒莧多糖體外抗氧化活性

2.7.1 馬齒莧多糖對DPPH·的清除作用

DPPH·是一種很穩定的氮族自由基，在無水乙醇溶液中呈紫色，被還原劑還原后顏色變淡甚至消失，被廣泛應用于評價物質的抗氧化活性[21]。由圖6 可以看出，馬齒莧多糖和VC 對DPPH·的清除能力與質量濃度呈現出較強的依賴關系，通過線性回歸方程計算得到馬齒莧多糖的半數清除率IC50為0.182 mg/mL，而VC 的IC50為0.234 mg/mL。說明在相同濃度下，馬齒莧多糖對DPPH·的清除能力強于VC。

圖6 馬齒莧多糖對DPPH·的清除作用Fig.6 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on DPPH free radical

2.7.2 馬齒莧多糖對·OH 的清除作用

·OH 是一種生物體內活性最強的氧族自由基，可與水楊酸反應生成紫色物質，加入抗氧化劑后，溶液顏色變淺甚至消失[21]。由圖7 可以看出，馬齒莧多糖和VC 對·OH 的清除能力與質量濃度呈現出較強的依賴關系，通過線性回歸方程分析，馬齒莧多糖對·OH 的IC50為0.305 mg/mL，而VC 對·OH 的IC50為0.340 mg/mL，說明馬齒莧多糖對·OH 的清除能力強于VC。

圖7 馬齒莧多糖對OH·的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Portulaca oleracea polysaccharides on OH free radical

3 結論

我國每年都會產生大量馬齒莧野生資源，大多作為飼料供動物食用或作為廢棄物被舍棄。研究表明，馬齒莧中含有豐富多糖成分，是一種極具經濟效益的天然多糖來源。本研究對馬齒莧多糖纖維素酶和果膠酶雙酶法提取條件進行了優化，確定了最佳工藝條件為：纖素酶和果膠酶加入量分別為1.5%和2.0%，酶解時間100 min，酶解溫度50 ℃，液料比25∶1（mL/g），此提取工藝具有良好的穩定性。最佳提取工藝條件下馬齒莧多糖得率為19.83 mg/g，高于單一纖維素酶或果膠酶法提取法得率。體外抗氧化試驗表明，馬齒莧多糖具有較好的清除DPPH·和·OH 活性作用。本試驗的研究成果為馬齒莧多糖作為保健食品實現工業化生產提供了理論支持，有著良好的發展前景。