復合抗氧化劑對凍藏大黃花魚片品質的影響

卿明民，陳 朋，臧靜楠，祁騰達，謝政澤，尚宏麗

（錦州醫科大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001）

大黃花魚是我國傳統四大海產之一，其肉質鮮美，深受廣大消費者喜愛。魚類的保鮮方法主要有低溫保藏、氣調保藏、化學和酶法保藏等，其主要機理是防止魚體接觸大量的微生物而發生腐敗變質[1]。隨著儲藏時間的延長，魚肉中含有的不飽和脂肪酸會分解，產生游離脂肪酸，對其品質和營養價值產生明顯的影響[2]。脂肪氧化后的一些產物又能使蛋白質發生氧化變性[3]。蛋白質的變性會致使魚肉中蛋白的乳化性、溶解度、蛋白疏水性和凝膠性改變，導致其原來特有的營養價值損失[4]。因此，有效地抑制凍藏過程中魚肉的氧化，將對魚肉品質的提升有著至關重要的作用。

抗氧化劑能夠明顯地抑制脂肪的氧化[5]，而化學抗氧化劑的安全性備受質疑[6]，天然抗氧化劑是目前的主要研究方向。付麗等[7]用不同濃度的茶多酚處理凍藏牛肉丸，發現0.5%的茶多酚對肉丸的抗氧化效果較好。趙艷芳等[8]利用天然抗氧化劑優化了鮐魚的儲藏加工條件。復合天然抗氧化劑的協同作用在抑制凍藏水產品的脂肪氧化方面效果明顯，為了全面提升凍藏大黃花魚品質，本研究選用VE、茶多酚和異抗壞血酸鈉3 種抗氧化劑對凍藏大黃花魚進行協同作用，利用響應面試驗優選出復合抗氧化劑配方，用掃描電鏡對復合抗氧化劑的效果進行驗證，擬為抗氧化劑在大黃花魚冷凍儲藏加工中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

大黃花魚每條規格為：（350±50）g，購于錦州市石橋子早市；水溶性VE、茶多酚、異抗壞血酸鈉，食品級，均為河南瑞仁生物工程有限公司產品；考馬斯亮藍法蛋白含量測定試劑盒，上海語純生物科技有限公司產品；2-硫代巴比妥酸、仲鉬酸銨（（NH4）6MO7O24·4H2O）、馬來酸、三磷酸腺苷二鈉（ATP）、Elon（硫酸-P甲胺酚）、濃硫酸、KH2PO4、HClO3、NaHSO3等試劑均為分析純，國藥集團試劑有限公司產品。

1.1.2 儀器與設備

TMS-PRO 質構儀，GL-21M 型高速冷凍離心機，FESEM JEOL 6700F 掃描電子顯微鏡（SEM），T18 基本型分散機。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理

鮮活大黃花魚放入裝有冰塊的保溫箱，迅速運到實驗室，去除魚頭、魚鱗及內臟，用蒸餾水洗凈后切片，每片約70 g，切片厚度約8 mm，長約80 mm，寬約40 mm。將切好的魚片置于各抗氧化劑溶液中浸泡1 h，各抗氧化劑添加量見表1，將蒸餾水浸泡處理1 h的大黃花魚肉設置為對照組（CK），以自封袋分裝并迅速置于-20 ℃冰箱內，凍藏35 d 后，取出魚片進行各項指標的測定。

表1 3 種天然抗氧化劑的添加量Table 1 Additions of three natural antioxidants

1.2.2 測定項目與方法

1.2.2.1 硬度

參考李鵬鵬等[9]的方法，在魚肉凍藏35 d 后，采樣于5 ℃的冷藏箱中，待魚肉中心溫度達到4 ℃時用質構儀進行硬度測定。測定參數：直徑5 mm 的通用柱形探頭P/5，下降速率3 mm/s，測試時速率1 mm/s，測試后返回速率1 mm/s，形變程度50%，測定時停留5 s，觸發力5 g。運用質構儀搭載的配套數據處理軟件進行數據采集。

1.2.2.2 持水性

取3 g 大黃花魚肉，稱取質量記為m1，用雙層濾紙包裹，在4 ℃、5 000 r/min 條件下離心，稱取離心后的濾紙質量為m2，魚肉持水性（W）[10]計算公式為：

1.2.2.3 Ca2+-ATPase 活性

參考曹淑敏等[11]的方法，并稍作修改。按表2 進行反應體系配制，25 ℃水浴10 min，加入1 mL 15%三氯乙酸使反應終止，將所得反應液離心5 min（6 500 r/min，4 ℃），取上清液1mL 于試管，依次添加1.0mL 硫酸鉬酸溶液（先將70 mL 濃硫酸加入434 mL 水中制成溶液，再稱取12.5 g（NH4）6MO7O24·4H2O，0.5 mL Elon 試劑（3 g NaHSO3溶解于97 mL 水中，再加入1 g Elon 溶解），2.5 mL 蒸餾水，充分振蕩，室溫下45 min 發色后，在吸收波長640 nm 處測定吸光值A。然后將預先在100 ℃干燥1 h 后置于干燥器中干燥冷卻的KH2PO4用5%HClO3溶解，配成0.5 mmol/L 的溶液作標準曲線?？瞻捉M在反應體系配制時，先加入TCA，再加入ATP 溶液，測得空白組吸光度值B。求出1 mg 蛋白質在1 min 內產生無機磷量。計算公式為：式中：X為Ca2+-ATPase 活性，μmol·（mg·min）-1；A為樣品組產生磷酸量，μmol；B為空白對照產生磷酸量，μmol；t為反應所用時間，min；m為1 mL 反應液所含酶的質量，mg。

表2 Ca2+-ATPase 活性反應體系Table 2 Reaction medium for investigating activity of Ca2+-ATPase

1.2.2.4 硫代巴比妥酸值（TBARS 值）

參考Witte 等[12]的方法，略有修改。取10 g 攪碎均勻的凍藏魚肉，加入低溫三氯乙酸溶液40 mL（質量分數5%），均質1 min（轉速13 800 r/min），靜置30 min，過濾，用三氯乙酸溶液（質量分數5%）將所得濾液定容至50 mL。取5 mL 上清液于比色管，再加入5 mL 硫代巴比妥酸溶液（0.02 mol/L），封口，置于90 ℃恒溫水浴中振蕩40 min 后冷卻至室溫。以加入5 mL 蒸餾水為對照組，在538nm 處測定吸光度（A538）。

式中：A538為所測樣品吸光度；V為樣品體積，mL；M為丙二醛的分子量72.063；ε 為摩爾吸光系數156 000；1 為光程，cm；m為樣品質量，g；1 000 為換算系數。

1.2.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選擇茶多酚（A）、VE（B）、異抗壞血酸鈉（C）為響應因子，以TBARS 值為響應值，選用Design Expert 8.0 設計響應面試驗，試驗因素水平見表3。

1.2.4 掃描電鏡分析

將每組樣品解剖縱切，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm魚背肉，樣品放入pH 7.4 的2.5%戊二醛溶液中，于4 ℃冰箱凍藏12 h，磷酸緩沖液沖洗3 次，使用1%鋨酸固定，將其置于4 ℃冰箱內再固定2 h，再用磷酸緩沖液沖洗3 次。經過50%～100%乙醇逐級脫水，醋酸異戊酯置換，常規臨界干燥以及真空離子鍍膜后用掃描電鏡觀察拍照。

1.2.5 數據處理

采用Origin 8.0 及Design Expert 8.0 和SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，顯著性水平設置為P＜0.05，每組樣品至少進行3 次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 硬度變化

硬度是評價魚肉品質的重要指標，硬度過低會導致魚肉口感不佳。由圖1 可知，茶多酚添加量0.4%時，魚肉硬度顯著高于VE 和異抗壞血酸鈉處理組（P＜0.05），說明茶多酚能夠有效抑制在冷凍環境下魚肉硬度的下降，這可能是因為茶多酚所含的多羥基結構阻礙魚肉脂肪氧化，進而延緩肌原纖維蛋白的變性，但隨后魚肉硬度呈下降趨勢，表明茶多酚在一定條件下會起到促氧化作用，這與Jongberg 等[13]研究發現綠茶提取物在巰基氧化生成二硫鍵中有促氧化作用一致。隨著VE 添加量增加，魚肉硬度增長緩慢；而隨著異抗壞血酸鈉添加量的增加，魚肉硬度增長不顯著。

圖1 不同添加量的抗氧化劑與大黃花魚片硬度的關系Fig.1 Relationships between different concentrations of antioxidants and hardnesses of Larimichthys croceas fillets

2.2 持水性變化

由圖2 可見，茶多酚添加量為0.4%時，魚肉持水性最佳，且顯著高于對照組（P＜0.05），研究者Siddaiah等[14]和Farouk 等[15]指出魚肉持水性的下降是由于蛋白質變性促使肌球蛋白和肌動蛋白結合增加，進而導致持水性下降，添加茶多酚后持水性有所提升，原因可能是茶多酚通過阻礙脂肪氧化來降低蛋白質變性程度，但添加量大于0.4%時，對應魚肉持水性呈下降趨勢，表明茶多酚的添加需要有一定限度。VE 添加量0.6%時的持水性與對照組差異不顯著，VE 對持水性的提升作用可能與其對細胞膜修復作用有關。異抗壞血酸鈉添加量為0.3%時，魚肉持水性顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 不同添加量的抗氧化劑與大黃花魚片持水性的關系Fig.2 Relationships between different concentrations of antioxidants and water holding capacities of Larimichthys croceas fillets

2.3 Ca2+-ATPase 活性變化

由圖3 可知，茶多酚添加量為0.2%時，Ca2+-ATPase活性顯著高于對照組（P＜0.05），茶多酚添加量為0.4%時，Ca2+-ATPase 活性最高，其活性越低則魚肉中肌原纖維蛋白的變性程度就越大[16]，相關研究指出茶多酚在適宜濃度下能抑制黃花魚片脂肪氧化[17]，但隨后曲線開始下降，其原因可能是高濃度茶多酚對蛋白酶起到一定抑制作用[18]，降低了魚肉的Ca2+-ATPase活性。VE 添加量為0.3%時，Ca2+-ATPase 活性顯著高于對照組（P＜0.05），隨后上升趨勢變緩，Saeed 等[19]將一定量的VE 加入到碎魚肉中，發現其可提高魚肉的肌原纖維蛋白Ca2+-ATPase 活性，但VE 添加量為0.2%時的Ca2+-ATPase 活性與對照組酶活相比無顯著差異，可能是因為低濃度的VE 抑制脂肪氧化能力不強，導致脂肪氧化產物與肌原纖維蛋白之間作用未被有效阻止，蛋白變性程度繼續增大，Ca2+-ATPase 活性降低。異抗壞血酸鈉添加量為0.6%時，魚肉的Ca2+-ATPase 活性最大，且顯著高于對照組（P＜0.05）。陳洪生等[20]認為，異抗壞血酸鈉的抗氧化作用很強，可通過有效抑制脂肪氧化，減少脂肪氧化產物對肌原纖維蛋白產生的影響，從而提高Ca2+-ATPase 活性。

2.4 TBARS 值變化

由圖4 可見，隨著茶多酚添加量的增加，對應曲線呈現先迅速下降后緩慢上升的趨勢，在添加量為0.4%時，魚肉TBARS 值顯著低于對照組（P＜0.05），可能是因為茶多酚清除多元不飽和脂肪酸自由基、單線態氧[21-23]，阻礙脂肪氧化所發生的鏈式反應，達到抗氧化作用，隨后曲線上升趨勢變緩，可能是因為茶多酚添加量過高對于某些抑制脂肪氧化的反應起到了反作用，導致抗氧化效果下降。VE 添加量為0.3%時，魚肉的TBARS 值顯著低于對照組（P＜0.05），但添加量0.3%～0.6%之間無顯著差異。異抗壞血酸鈉添加量為0.4%時，魚肉的TBARS 值顯著低于添加量為0.2%時的TBARS 值（P＜0.05），但添加量大于0.3%的各組之間無顯著差異，說明異抗壞血酸鈉為0.4%時，即能起到有效的抗氧化作用。

2.5 響應面試驗結果

2.5.1 響應面試驗方案及結果根據單因素試驗結果，采用響應面法對復合抗氧化劑配比進行優化，試驗方案及結果見表4。

2.5.2 回歸模型的建立及方差分析

對表4 中的數據完成多元線性回歸擬合，得到凍藏期間大黃花魚片TBARS 值與各天然抗氧化劑用量的二次多項回歸方程為：

表4 響應面試驗設計及結果Table 4 Response surface experimental design and results

系數絕對值的大小表示各響應因素對響應值TBARS 值的影響程度，其正、負代表影響方向[24]，該多元線性回歸方程的方差分析見表5。

表5 響應曲面二次回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted response surface model

由表5 可知，模型項P值為0.001 2，小于0.01，說明該試驗選用的模型極顯著，方差的擬失項P值為0.107 2，大于0.05，不顯著，表明回歸模型擬合較好，該模型可用于試驗結果的統計分析，R2=0.999 8，說明該模型的預測值與實測值之間有較好的相關性[25]。3 個因素中一次項A、C及二次項C2對響應值（TBARS 值）影響達極顯著水平（P＜0.01）；一次項B、二次項B2及交互項AB、AC、BC對響應值（TBARS 值）的影響達顯著水平（P＜0.05）；A2項對響應值影響不顯著。這說明茶多酚、VE 及異抗壞血酸鈉用量均顯著影響凍藏大黃花魚的TBARS 值。由F值可得，各因素對TBARS 值影響的主次順序為：茶多酚＞異抗壞血酸鈉＞VE，茶多酚與VE、茶多酚與異抗壞血酸鈉、VE 與異抗壞血酸鈉之間均存在協同增效作用，它們對TBARS 值的影響主次順序為：茶多酚×VE＞茶多酚×異抗壞血酸鈉＞VE×異抗壞血酸鈉。

2.5.3 因素間的交互作用分析

為進一步研究各因素間的協同作用，通過回歸方程來繪制茶多酚、VE、異抗壞血酸鈉對TBARS 值影響的響應面圖和等高線圖（圖5）。陡峭的響應曲面圖代表響應值很大程度上受該因素的影響，反之影響不大[26]，呈橢圓形的等高線圖代表兩個因素之間的相互作用強，反之則弱[27]。如圖5 所示，從響應面圖可以直觀看出茶多酚對大黃花魚的TBARS 值影響最大，其次是異抗壞血酸鈉，VE 的影響最??；3 個等高線圖均呈現一定程度的橢圓形，圖5a2中等高線的橢圓形狀最明顯，表明茶多酚與VE 之間存在明顯的交互效應；圖5b2中等高線形狀也呈橢圓，雖橢圓形狀較圖5a2弱一些，但也表明茶多酚與異抗壞血酸鈉之間有明顯的交互作用；圖5c2中等高線呈現完整橢圓形，表明VE 與異抗壞血酸鈉之間也存在交互作用。可見茶多酚、VE、異抗壞血酸鈉3 種天然抗氧化劑兩兩之間存在交互作用，如將三者復合將對魚肉品質提升有更優效果。

圖5 各因素間的交互作用對大黃花魚片TBARS 值影響的響應面圖及等高線圖Fig.5 Response surface graphs and contour maps showing the interactive effects of various factors on TBARS values of Larimichthys croceas fillets

2.5.4 復合抗氧化劑配比優化及驗證性試驗

根據回歸模型分析可知，TBARS 值為0.0595mg/kg工藝最優條件為：茶多酚添加量0.40%，VE 添加量0.29%，異抗壞血酸鈉添加量0.30%，做3 次平行試驗TBARS 值為0.061 3 mg/kg，與理論值0.059 5 mg/kg接近。說明該模型能較好地預測實際TBARS 值。

2.6 掃描電鏡結果分析

大黃花魚在凍藏過程中表面三維結構的變化可以利用具有高分辨率掃描電子顯微鏡觀察，其中魚肉肌肉纖維結構變化是掃描電鏡使用電子束掃描魚肉樣品的檢測指標。如圖6a 所示，新鮮大黃花魚背肉的組織結構通過掃描電鏡觀察，肌肉排列整齊，肌肉組織保持明顯和均勻的明暗相間的條紋結構，肌漿網結構完整，說明新鮮魚肉的肌肉質地非常好，組織結構完整，未受到任何損傷。如圖6b 所示，未添加抗氧化劑的凍藏35 d 的大黃花魚組織結構通過掃描電鏡觀察可以看到，大黃花魚背肉肌肉排列雜亂無章，肌肉組織明暗相間的條紋結構徹底消失，這說明未添加抗氧化劑凍藏35 d 的大黃花魚肌肉組織結構受到了嚴重的破壞和損傷。如圖6c 所示，添加最優組合抗氧化劑的凍藏35 d 的大黃花魚組織結構通過掃描電鏡觀察可以看到，大黃花魚背肉肌肉排列只有較小的變化，肌肉組織依然保持著較均勻的明暗相間的條紋結構，這說明添加了最優組合抗氧化劑的凍藏大黃花魚肉組織結構只受到了較少破壞，復合抗氧化劑對凍藏大黃花魚具有很好的保護效果，抑制了魚肉品質變壞，對冷凍魚肉的氧化變性起到了積極的抵抗作用。

圖6 各組黃花魚樣品掃描電鏡結果Fig.6 Scanning electron microscopy results of Larimichthys croceas in each group

3 結論

通過單因素試驗確定茶多酚、VE 及異抗壞血酸鈉的較優抗氧化濃度范圍，在所選濃度范圍中，以TBARS 值為響應值，對茶多酚、VE、異抗壞血酸鈉進行響應面法優化抗氧化劑的復配，得到最優復合抗氧化劑配方為：茶多酚添加量0.40%，VE 添加量0.29%，異抗壞血酸鈉添加量0.30%，此時TBARS 值為0.061 3 mg/kg。利用掃描電鏡分析發現，大黃花魚肉用該復合抗氧化劑溶液浸漬處理后，能明顯減少其因凍藏引發的肌肉纖維結構損壞，且能有效抑制其因脂肪氧化引發的組織損傷，表明該復合抗氧化劑能有效提升大黃花魚凍藏品質。