比色法輔助下紫外分光光度法測定蘆山藤總黃酮含量

陳惠媚 黃 穎 劉夢君 吳鴻羽 張倚瑋 黎蔚玲

廣西中醫藥大學賽恩斯新醫藥學院，廣西 南寧 530000

蘆山藤是菊科植物巖穴千里光Cissamp-elopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉，具有活血、止痛、祛風除濕等功效，用于治療跌打損傷、風濕骨痛、小兒驚風等癥[1]。早記載于《中國高等植物圖鑒》。而在《貴州植物志》中記載的蘆山藤別名為巖生藤菊。產于四川、貴州、云南、廣西[2]。據前期的瑤藥調查發現，蘆山藤除了友誼關分布外，廣西壯族自治區金秀瑤族自治縣的大多數地方也有分布。但是通過查閱國內外文獻，發現瑤藥蘆山藤的化學成分、藥理活性、質量控制等方面的相關報道、研究較少。梁爽等[3]從糯米風75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個化合物。為了進一步研究蘆山藤的化學成分，本實驗利用已有的測定總黃酮方法，如陳凌霆等[4]采用超聲輔助顯色測定黃芪總黃酮含量對廣西瑤藥蘆山藤的總黃酮含量測定進行研究。現報告如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 SHIMADZU電子天平(AUY220)；紫外分光光度儀(北京普析通用儀器有限公司-TU-1901)；昆山市超聲儀器有限公司(KQ5200DE型數控超聲波清洗器)。

1.2 藥品 蘆丁標準品購買于上海詩丹德標準技術服務有限公司，批號：5981；藥材及鑒定蘆山藤：2019年購于廣西金秀縣，經廣西中醫藥大學壯醫藥學院韋松基教授鑒定為菊科植物巖穴千里光Cissampelopsisspelaeicola(Vant)C.Jeffrey et Y.L.Chen的干燥莖葉。實驗室常用藥品，試劑，本實驗中所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 提取總黃酮 準確稱取被粉碎蘆山藤2.000 g后于干燥錐形瓶中用70%乙醇(料液比1∶30)，60 ℃溫度下超聲提取30 min，超聲輔助乙醇提取法冷卻過濾，制得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁標準品10 mg，放入容量瓶(100 mL)中，加70%乙醇溶解后定容，即配成蘆丁標準溶液(0.1 mg/mL)，放入冰箱備用。

2.3 確定最大吸收波長 顯色劑(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)顯色，顯色時間參考李敏等[5]研究，在空白組對照下，測得供試品溶液的最大吸收波長，在360～700 nm范圍內最大吸收波長為406 nm。如圖1所示。

2.4 標準曲線的制備 分別精密量取標準溶液3.0、5.0、7.0、9.0、11.0、13.0 mL，置于容量瓶(25 mL)，用70%乙醇稀釋至25 mL，加1.00 mLNaNO2溶液(5%)，搖勻，放置6 min，加入8%Al(NO3)3溶液1.00 mL，搖勻，放置6 min，再加入10 mL 5%NaOH溶液，用70%乙醇定容，放置15 min用 0.0 mL標準溶液組作為空白對照組，在406 nm波長中測定其吸光度，并繪制標準曲線如圖2所示，結果表明蘆丁在18.4～53.6 μg/mL范圍內有良好的線性關系。A=0.01288C+0.01587，r=0.9998。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密性實驗的測定 精確量取上述供試品溶液2 mL，參照“2.4”項顯色及測定吸光度的方法制備，連續測定5次，RSD為0.90(n=5)，結果表明，該方法具有良好的精密度見表1。

表1 精密性實驗結果

2.5.2 重現性實驗 取同一批蘆山藤藥材，按照供試品溶液制備的方法制備5份供試品溶液，各取2 mL，并按照“2.4”項的顯色方法制備后測定其吸光度，計算測得總黃酮的平均含量為13.48 mg/g，RSD為1.75，實驗結果說明該方法的重復性良好。見表2。

表2 重現性實驗結果

2.5.3 穩定性實驗的測定 在室溫條件下，精確吸取供試品溶液1 mL并參照“2.4”項的方法制備顯色后測定其吸光度，分別在有光和無光的條件下，靜置不同時間后分別測定吸光度，結果見表3、表4。

表3 光線條件下穩定性的測定

表4 無光條件下穩定性的測定

由表3、表4可見，在有光和無光的條件下RSD(%)分別為2.4和2.85，結果表明該實驗在室溫條件中40 min內具有良好的穩定性。

2.5.4 加樣回收率 實驗精密吸取已知含量的蘆山藤供試品溶液6份，每份1 mL分別添加0.1 mg/mL蘆丁對照品溶液4 mL按照“2.4”項的方法制備，顯色后測定其吸光度，并計算回收率。試驗結果平均回收率為99.0%，RSD為2.50%，表明該方法具有良好的回收率。見表5。

表5 加樣回收率實驗結果

2.6 樣品含量的測定 準確稱取蘆山藤藥材粉末1 g，將這藥材分成3組，配制成供試品溶液按照“2.4”的顯色方法制備成供試品溶液：各精密量取2 mL上述制備成的供試溶液置于容量瓶(25 mL)中，加70%乙醇定容，加入顯色劑按(5%Na- NO2-8% Al(NO3)-5%NaOH)，在406 nm的波長下測定吸光度，并計算出蘆山藤總黃酮的含量。見表6。

表6 樣品含量測定結果

根據整個實驗結果數據分析表明，在顯色條件為5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH下，得廣西金秀縣蘆山藤總黃酮的平均含量為1.28%，實驗回收率為99.0%。實驗中精密度，重現性以及加樣回收率的RSD分別為0.90、1.75、2.50，穩定性在有光和無光下的RSD為2.40、2.85都符合要求。

3 討論

瑤藥種類繁多，但是目前對瑤藥研究以及開發利用相對較少，而蘆山藤的研究更是缺乏，梁爽等[3]從糯米風75%乙醇提取物中共分離鑒定出12個化合物，主要為萜類、酚酸類、黃酮類等，其成分及藥理作用的研究尚未見相關報道。本實驗主要對蘆山藤的總黃酮進行含量測定；而總黃酮具有較多功效和作用，李磊等[6]研究表明黃芩總黃酮具有顯著的降血脂作用；對缺血再灌注損傷的保護作用, 如紀影實等[7]研究表明山楂葉總黃酮能夠降低細胞膜的損傷,具有膜穩定性的作用，其能夠提高機體清除自由基的能力,而且能顯著降低血清中的肌酸激酶以及乳酸脫氫酶的活性。其還具有抗炎作用，柴玲等[8]研究表明擬草果可顯著下調炎癥因子IL-6的表達。所以該實驗的研究不但能夠促進瑤藥的發展，而且能促進蘆山藤在降血脂、抗炎等方面開發和利用。本實驗在已有的測定總黃酮實驗的條件下測定吸光度，其最大吸收波長為406 nm，線性方程為A=0.01288C+0.01587，總黃酮的回收率為99.0%，相對偏差RSD為2.50。實驗表明，該方法重復性、穩定性、回收率、精密度均符合含量測定要求，操作簡單，結果可靠。該研究可以為蘆山藤開發與利用提供進一步的理論依據。