HPLC法測定消栓顆粒劑中黃芪甲苷的含量

王法宇 吳 迪 趙鳳明 袁家欣

1.北京醫藥集團職工大學,北京 100079;2.吉林省白城市食品藥品檢驗所，吉林 白城 137000；3.吉林敖東鹿業有限責任公司,吉林 長春 133700

消栓顆粒劑出自清朝名醫王清任的《醫林改錯》卷下癱痿論方[1]。該方特點為重用黃芪為君藥，其黃芪用量是其它活血藥總和的約3倍，方中重用的黃芪中含有多糖及黃芪甲苷[2-4],同時黃芪還具有抗炎、增強免疫[5-6]、抗氧化[7]、保護心臟[8]、調脂[9]、降血糖[10]等作用。黃芪甲苷作為黃芪的主要有效成分，在我國藥典中有含量測定并有相關含量限度規定[11]。本研究建立消栓顆粒劑中黃芪甲苷含量測定方法，進一步細化藥品的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器 液相色譜儀(Agilent 1100) 檢測器為四元泵二極管陣列，數據轉換器為Agilent35900E蒸發散射檢測器(SEDEX-55)，單元泵(DXNamax-SD-200) ，AgII空氣發生器電子天平(Mettler instrument Corp)，超聲波提取器(型號GT-350W型濟寧科特超聲電子有限公司)。

1.2 藥品 消栓顆粒( 自制的三批藥品分別為20190905 20190904 20190902)自制的黃芪陰性對照；黃芪甲苷對照品(中檢所110781201717)；乙腈(色譜純)；其它試劑(分析純)。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備 ①供試品溶液的制備：取本品7 g，精密稱定，加氨試液40 mL移至具塞三角瓶中搖勻，密閉，過夜。取此提取液以40 mL水飽和正丁醇萃取，共萃取3次后合并正丁醇萃取液，將其水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解后移至5 mL容量瓶中，并稀釋到刻度，然后取上清液，用濾膜過濾(0.45 μL)，即得；②對照品溶液配制：稱取黃芪甲苷對照品0.5 mg加甲醇配制成每毫升含0.5 mg的溶液；③陰性對照：按上述工藝配制缺黃芪的陰性對照品溶液。精密吸取上述①②③各10 μL測定。結果①和②在相同時間內出現相對應的色譜峰，而③則未出現。相關圖譜如圖1所示。

2.2 色譜條件 Nanologica SVEA C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-水(35∶65)為流動相；蒸發光散射檢測器。1.0 mL/min為流速，柱溫為25 ℃，理論塔板數不低于4000，以黃芪甲苷峰計算。進樣量為10 μL。

2.3 標準曲線與線性范圍 黃芪甲苷對照品溶液(濃度為0.47 mg/mL)精密吸取4～30 μL，進行測定峰的面積，縱坐標(Y)為峰面積log值，橫坐標(X)為進樣量log值，回歸處理，結果顯示黃芪甲苷在0.2742～1.1492 μg范圍內，峰面積的積分值與進樣量之間呈良好的線性關系，回歸方程為Y=1.4709X+2.7033，R=0.9994(n=6)。

2.4 精密度試驗 精密地吸取上述同一對照品溶液10 μL，在測試的條件和測試的地點相同的前提下，重復進樣6次后測定黃芪甲苷的峰面積，并計算相對標準偏差，取6次RSD的平均值以記錄。結果表明黃芪甲苷的平均峰面積為5527.88，RSD為1.45%，該方法精密度較好。

2.5 重復性試驗 同批次的樣品為供試品，按上文所述的方法配制供試品溶液，依上述方法重復進行含量平行測定。黃芪甲苷重復性試驗結果的平均值為7919.53，RSD為1.63%。由以上可知，此方法的重復性良好。

2.6 穩定性實驗 取本品供試品溶液，分別放置0～24 h，每次吸取10 μL測定。結果平均峰面積為7519.55，RSD為1.87%。結果顯示，供試品溶液在24 h內穩定。

2.7 加樣回收率 精密地稱取已知含量的同一樣品6份，其每份黃芪甲苷含量約1.25 mg。精密地加入對照品溶液(含黃芪甲苷為1.2404 mg)按以上樣品測定項下的方法提取，測定含量并計算回收率，平均回收率為99.16%，RSD為1.21%，結果見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.8 檢出限 取黃芪甲苷對照品配置成濃度為0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.003 mg/mL、0.004 mg/mL、0.005 mg/mL、0.006 mg/mL、0.008 mg/mL、0.01 mg/mL的對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，進樣量為10 μL，計算不同進樣量的信噪比，經測定，濃度為0.005 mg/mL的黃芪甲苷進樣量為10 μL時，其信噪比為3，因此確定黃芪甲苷的最低檢出限為0.05 μg。

2.9 樣品含量測定 取10批次的上述樣品，按供試品溶液的方法配制并測定其峰面積，再用外標兩點法對數方程計算樣品中黃芪甲苷的含量，測定結果見表2。考慮到每批藥材之間質量差異和生產實際，最后將黃芪甲苷的含量定為不低于0.70 mg/g。

表2 消栓顆粒劑中的黃芪甲苷的含量

3 討論

黃芪為方中君藥，其主要成分黃芪甲苷的含量測定可以做為控制消栓顆粒劑質量的指標性成份。本試驗結果顯示，黃芪甲苷平均加樣回收率為 99.16%，RSD 為1.21%。樣品中黃芪甲苷出峰時間為15.6 min，且樣品峰與其他峰的分離度很好。陰性對照試驗表明，除黃芪外的其他原輔料不干擾樣品中黃芪甲苷的含量測定。表明本結果準確，重復性良好，可用于對消栓顆粒劑的質量控制，從而保證臨床應用中制劑的療效和安全。