白芷-川芎藥對鎮痛作用研究

覃文玉 楊丹淇 張源文 王映雪 劉 楊，2 劉 明，2*

1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫藥大學中藥、民族藥藥理作用及作用機制研究中心，貴州 貴陽 550025

2015年版《藥典》收載的“都梁丸”由白芷、川芎(白芷：川芎=4:1)組成，具有祛風散寒、活血通絡的功效，用于風寒瘀血阻滯脈絡所致的頭痛，癥見頭脹痛或刺痛、痛有定處、反復發作、遇風寒誘發或加重[1]。現代藥理研究表明，白芷-川芎藥對的鎮痛作用顯著[2-3]，但其鎮痛的作用機制不明。筆者采用醋酸致小鼠扭體實驗，觀察白芷-川芎藥對的鎮痛及其調節大腦神經遞質表達的作用。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級KM小鼠42只，雌雄各半，體重18～22 g，購于湖南省長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑 白芷，購買于貴州藥材市場，經貴州中醫藥大學生藥教研室吳之坤副教授鑒定為川白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.的根；川芎，購買于貴州藥材市場，經貴州中醫藥大學生藥教研室吳之坤副教授鑒定為川芎LigusticumchuanxiongHort.的根莖；阿司匹林腸溶片(批號：201904178，辰欣藥業股份有限公司)；醋酸(批號：20181217，湖南爾康制藥股份有限公司)；5-HT、PGE2試劑盒(批號分別為：NO.20190725B、NO.20190723A，武漢博士德公司)；DA抗體(批號：NO.ab19316，Abcam公司)。

1.3 儀器 680型全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司)，電泳儀和凝膠成像系統(BIO-RAD公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備 取白芷10 g，川芎2.5 g(2015年版《藥典》收載的白芷、川芎單用量均為3～10 g，本研究選擇白芷10 g∶川芎2.5 g=4∶1作為都梁丸的處方，人的體重按照60 kg計算，則人日用都梁丸為生藥量12.5 g/60 kg，小鼠劑量設為 2.08 g/kg，相當于人用量的10倍。)，參照文獻方法[4]，經70%乙醇滲漏提取，回收乙醇，濃縮，4 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 醋酸致小鼠扭體實驗 取KM小鼠42只，隨機分為3組，即正常對照組、白芷-川芎藥對組、阿司匹林組，雌雄各半，每組14只。灌胃給予相應的藥物，20 mL/kg，每日1次，連續7次，正常對照組給予等容量的生理鹽水灌胃。末次給藥0.5 h，每只小鼠腹腔注射0.6%的醋酸溶液 0.2 mL，立即計時，觀察記錄注射醋酸后15 min內小鼠出現的扭體次數，并計算鎮痛百分率。

鎮痛百分率(%)=(正常對照組平均扭體次數-給藥組平均扭體次數)/正常對照組平均扭體次數×100%

1.4.3 ELISA檢測腦組織5-HT、PGE2含量 注射醋酸后30 min，處死小鼠，分離大腦，隨機取7只小鼠的大腦加9倍的預冷生理鹽水勻漿，3500 r/min離心20 min，取上清，按照試劑盒說明書檢測5-HT、PGE2含量。

1.4.4 Western blot檢測腦組織DA蛋白表達 另取7只小鼠大腦，液氮凍存，根據試劑盒說明，做大腦總蛋白提取后，BCA法蛋白定量。按試劑盒操作步驟制備濃度12%分離膠和濃度5%濃縮膠，80 V電壓電泳2 h后60 V電壓轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗，β-actinⅠ抗濃度1∶6000、DAⅠ抗1∶500，Ⅰ抗4℃孵育過夜后加入Ⅱ抗1∶10000，室溫孵育2 h，TBST沖洗3次，ECL顯影，上機檢測，以β-actin作為內參，灰度分析。

2 結果

2.1 白芷-川芎藥對對小鼠扭體反應的影響 白芷-川芎藥對組能明顯減少扭體次數，其鎮痛百分率達到60.9%，高于阿司匹林組的51.3%，表明白芷-川芎藥對具有明顯的鎮痛作用。見表1。

表1 白芷-川芎藥對對醋酸所致小鼠扭體反應的影響

2.2 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織5-HT、PGE2含量的影響 白芷-川芎藥對組能明顯增加小鼠時腦組織中5-HT的水平，減少PGE2的含量。見表2。

表2 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織5-HT、PGE2含量的影響

2.3 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織DA表達的影響 白芷-川芎藥對組能明顯增加小鼠腦組織中DA的表達。見表1、如圖1所示。

表3 白芷-川芎藥對對小鼠大腦組織DA表達的影響

3 討論

白芷是一味歷史悠久且應用十分廣泛的中藥，始載于《神農本草經》，被列為中品，味辛、苦、溫，歸肝、腎、膀胱經，有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿的功效，同時有消瘀、止血、通便等作用，可用于治療風寒感冒、陽明頭痛、眉棱骨痛、風濕痹痛等癥，是治療陽明經頭痛的要藥[5]。川芎，別名芎藭、生川軍、香果，辛溫香燥，走而不守，既能行散，上行可達巔頂；又入血分，下行可達血海，常用于活血行氣，祛風止痛之證[6]。白芷、川芎均為祛風止痛之藥，均可上行頭目并分別入太陽經和陽明經。古方以白芷一味為都梁丸洽諸風眩暈，偏正頭痛甚佳。近代都梁丸則含白芷、川芎兩味，用于頭痛眩暈，眉棱骨痛，僧寒發熱。諸多止頭痛方中含白芷、川芎藥對[7]。

身體的疼痛通常是指由身體損傷、病患或不良的外部刺激所引起的不舒服感覺[8]。出于臨床的需要，國際疼痛研究協會將疼痛定義為“由真正存在或潛在的身體組織損傷所引起的不舒服知覺和心理感覺”。盡管疼痛發病機制復雜，但已有的研究表明，神經遞質在疼痛的發生、發展過程中占據重要的地位。PGE2是一種重要的細胞生長和調節因子，是前列腺素的一種，也是一種重要的疼痛遞質之一，存在于動物和人體中，其過量增加會引起疼痛產生。5-HT是一種抑制性神經遞質，其含量增加也能減少疼痛。DA是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經遞質，是內源性含氮有機化合物，其蛋白含量表達增加能夠興奮大腦，起到減輕疼痛的作用[9]。盡管一般認為，扭體法適合評價外周鎮痛，熱板法適合評價中樞鎮痛，但也有研究表明[10]在醋酸致小鼠扭體實驗中，小鼠大腦組織中PGE2含量顯著下降，故本研究選擇小鼠扭體實驗觀察白芷-川芎藥對對腦神經遞質含量的影響。

本研究結果顯示，白芷-川芎藥對具有明顯的減少醋酸致小鼠扭體反應數，降低腦組織中PGE2的含量，增加腦組組中5-HT含量及DA蛋白表達水平，這與相關的報道一致，提示白芷-川芎藥對發揮鎮痛作用可能是通過調節腦內神經遞質，從而影響疼痛遞質的水平而產生鎮痛作用。課題組后續將繼續深入研究白芷-川芎藥對鎮痛的物質基礎和作用機制。課題組后續將繼續深入研究白芷-川芎藥對鎮痛的部位、物質基礎和作用機制。