益腎通脈方改善腦缺血再灌注大鼠神經功能初步研究

郭延林 張樹泉 王小亮

山東省泰安市中醫醫院腦病科,山東 泰安 271000

腦梗死為臨床常見多發疾病，是我國發病率、致殘率、病死率最高的疾病之一，給家庭和社會帶來了極大的負擔。超早期靜脈溶栓和機械取栓治療是目前急性腦梗死具有循證醫學證據的治療方法，腦血管再通治療可挽救“缺血半暗帶”，使其向正常組織轉化或穩定不繼續惡化[1]。超早期血管開通治療后可通過“氧化應激”“炎性反應”等多種渠道發生“缺血-再灌注(I/R)”損傷[2]，加重腦組織損傷，導致神經功能缺損加重。因此，如何減輕和改善腦缺血再灌注損傷成為腦梗死患者腦血管開通治療后的又一嚴峻挑戰。中醫藥在腦梗死的治療中積累了豐富的經驗，為探索中醫藥改善腦缺血再灌注損傷的效果和作用機制，在前期臨床研究的基礎上，本研究采用益腎通脈方干預腦缺血再灌注大鼠，觀察其神經功能缺損情況和相關血液學指標，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體質量260～280 g，購自山東中醫藥大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK-(魯)2019-0005。

1.2 藥物與制劑 益腎通脈方(制首烏20 g，山茱萸15 g，肉蓯蓉15 g， 炒山藥15 g，麥冬15 g，石斛15 g，五味子5 g，菖蒲10 g，郁金10 g，茯苓30 g，當歸30 g，川芎30 g，全蝎10 g，益母草30 g，炙甘草5 g)，由泰安市中醫醫院藥劑科北京康仁堂顆粒藥房提供。分別加蒸餾水制成低劑量(1 mL含2.5 g生藥)、高劑量(1 mL含5 g生藥)的混懸液。

1.3 方法

1.3.1 分組 所有大鼠隨機分為假手術組、模型組、益腎通脈低劑量組和益腎通脈高劑量組4組，各10只。

1.3.2 模型制作 模型組、益腎通脈低劑量組和益腎通脈高劑量組參照Zea Longa[3]采用線栓法制作腦缺血再灌注模型：術前動物禁食禁水 12 h，稱質量后腹腔注射水合氯醛(3.0 mL/kg)麻醉，待大鼠麻醉后固定，用電動剃須刀清理頸胸部鼠毛，碘伏消毒，切開皮膚，逐層分離直至暴露右側的頸總動脈(CCA)和迷走神經，再依次分離暴露CCA分叉部，頸內動脈(ICA)，頸外動脈(ECA)，后將尼龍縫合線從CCA插入ICA并向前推動，以阻斷至左大腦中動脈(MCA)直至出現輕微阻力，腦缺血1 h后拔出線栓進行缺血再灌注。假手術組只進行血管神經分離，不插入線栓。判斷造模成功標準：①懸尾實驗不能完全伸展對側前爪；②前肢抵抗對側推力能力下降；③出現追尾現象。出現上述癥狀之一即為造模成功。

1.3.3 給藥治療 造模成功24 h后，益腎通脈低劑量組、益腎通脈高劑量組分別給予低劑量混懸液、高劑量混懸液各2 mL；假手術組和模型組給予2 mL的蒸餾水。每日1次，給藥治療時間為3 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 神經功能評定 實驗開始后，采取改良Bederson評分法[4]每天對大鼠的神經功能損傷程度進行評分：總分4分，其中無明顯損傷記0分；受損腦對側前肢蜷縮，不能完全伸展記1分；向受損腦的對側轉圈記2分；向受損腦的對側傾斜記3分；身體癱軟且無意識記4分。神經功能損傷程度隨分值增大而加重。

1.4.2 血液學指標 實驗結束后，經腹主動脈取血靜置，分離血清，分別測定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、內皮素-1(ET-1)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、一氧化氮(NO)水平。

2 結果

2.1 益腎通脈方對大鼠神經功能缺損的影響 假手術組大鼠由于并未進行動脈栓塞，故未出現腦梗死缺血癥狀，在7、14 d神經功能缺損評分均為0分。模型組大鼠7、14 d神經功能缺損評分均明顯高于其他組，差異均有統計學意義(P<0.05);隨著益腎通脈方劑量的增加，大鼠神經功能缺損評分逐漸降低，且在7、14 d各劑量益腎通脈方組大鼠神經功能缺損評分均明顯低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示益腎通脈方在改善腦缺血再灌注大鼠神經功能缺損方面起到顯著作用。見表1。

表1 四組大鼠神經功能缺損評分比較

2.2 血液學指標的變化 通過不同的試劑盒對血液指標的檢測發現，與假手術組比較，在其他三組大鼠體內，MDA，HIF-1α，ET-1，eNOS和NO的含量均增加了，而SOD的含量出現降低。MDA和NO的含量在四組中的變化均不明顯。與假手術組相比，SOD的含量在模型組和益腎通脈低劑量組中顯著下降(P<0.05)，HIF-1α、ET-1在其他三組中顯著增加(P<0.05)，eNOS的含量在模型組和益腎通脈低劑量組中顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，SOD的含量在益腎通脈高劑量組中顯著升高(P<0.05)，HIF-1α、eNOS的含量在益腎通脈高劑量組中顯著減少(P<0.05)。這些結果表明，益腎通脈處方對缺血再灌注大鼠血清SOD，HIF-1α和eNOS的含量均顯示出顯著的改善作用，但對ET-1的含量影響不顯著。見表2、表3、圖1。

表2 四組大鼠血清MDA、SOD、HIF-1α比較

表3 四組大鼠血清ET-1、eNOS、NO比較

圖1 四組大鼠血液學指標比較

3 討論

腦梗死即缺血性腦血管病(ischemic cerebrovascular disease,ICVD)是由于腦血管狹窄或閉塞,腦組織因血流消失處于缺血、缺氧狀態,后期出現腦組織壞死軟化,從而導致神經功能缺損的一類疾病,具有高發病率、高致死致殘率、高復發率等特點,嚴重威脅人民健康。隨著靜脈溶栓技術、腦血管支架成形術、血管內機械取栓治療水平的提高，腦血管得以再通的同時，腦缺血再灌注損傷也越來越成為學術界關注的重點和熱點。腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是腦缺血一定時間后，再次恢復血液供應時,通過級聯反應對腦組織造成的再次損傷，常導致神經功能缺損、腦梗死和腦水腫等并發癥的出現，嚴重者可出現腦出血,引起嚴重功能障礙。缺氧情況下星形膠質細胞釋放炎癥介質,缺血再灌注后腦組織內滲入血液系統成分,引發血源性水腫,從而使得體內超氧化物歧化酶(SOD)活性,丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、血清白介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)等表達上調[5]。SOD活性表明機體抗氧化能力,MDA表明細胞受損傷程度,而NO參與缺血性損傷的病理機制，IL是腦缺血急性期的重要炎癥介質，TNF在腦缺血再灌注后誘導的白細胞浸潤和組織損傷中發揮重要作用。ET-1是血管活動的重要調節因子之一，具有強效的調節血管收縮作用，其參與新生血管生成和血管重塑，促進細胞外基質合成，尤其在血栓性疾病的病理改變過程中發揮著重要的調節作用[6]。HIF-1α是腦組織缺血、缺氧狀態的重要信號分子，對缺血缺氧環境中組織細胞的能量代謝、血管舒縮功能、炎癥反應、血管再生以及細胞衰亡等方面具有提示作用[7]。

本課題組在研讀歷代醫家理論經驗記載和最新醫學研究進展的基礎上，結合自身臨床體會，逐步形成了“以傳統中醫辨證論治為主線，充分利用現代科技，以取象比類的思維方式，全面實現中醫現代化”的學術思想，在此指導下，把傳統中醫病機與現代病理結合，傳統中藥功效與現代藥理結合，采用中醫傳統辨證與現代微觀辨證相結合的辨證方法，積極開展缺血性中風的理論與臨床研究?；趥鹘y醫學與現代醫學認識，本課題組提出腦梗死的發生,是由于腎虛痰瘀內生或其他因素致生痰瘀,阻于腦絡而發。腦組織缺血壞死可視為腎虛腦消髓減的微觀指征, 核心梗死周圍缺血半暗帶可視為血瘀的微觀指征, 梗死周圍水腫可視為痰阻的微觀指征。因此，本學科提出腎虛血瘀痰阻是急性腦梗死的重要病機, 補腎活血化痰是急性腦梗死的基本治法[8]。據此理論，本課題組擬定益腎通脈方，應用于急性腦梗死患者，前期臨床研究[9]發現，使用益腎通脈方治療急性腦梗死，可加速水腫消退，改善神經功能缺損，提高日常生活能力，減輕殘障程度。

本研究結果顯示：采用益腎通脈方干預腦缺血再灌注大鼠，可很好地改善神經功能缺損，升高血清SOD水平，降低血清HIF-1α和eNOS含量，提示益腎通脈方改善腦缺血再灌注大鼠神經功能的作用機制可能與抗氧化、減輕炎癥反應有關，在一定程度上可起到腦保護作用。本研究仍存在一些不足，比如樣本量較少導致部分檢測指標沒有出現顯著差異，只進行了單一時間點檢測、未開展時間-效果關系分析等，在今后的研究中當進一步完善。