禽坦布蘇病毒及其蛋白功能研究進展

陳 珍 沈意興 陳翠騰 朱春華 劉斌瓊 蔡國漳 黃 瑜＊

（1.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所 福州 350013；2.福建省農業科學院畜牧獸醫研究所動物生物安全三級實驗室 福州 350013；3.福建省禽病防治重點實驗室 福州 350013；4.清流縣龍津鎮鄉村振興綜合服務中心 福建三明 365300）

禽坦布蘇病毒病是由禽坦布蘇病毒（Avian tembusu virus，ATMUV）引起的、造成多種蛋禽產蛋下降的一種新發疫病。近年來，在我國、馬來西亞、泰國等多地的蛋鴨場、種鴨場、肉鴨場暴發流行[1-3]，給養禽業造成巨大的經濟損失。

1 禽坦布蘇病毒的的分類與基因組結構

ATMUV屬于黃病毒科（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）恩塔亞病毒群（Ntaya virus group）中的一員[1,4-6]。病毒呈球形，直徑約50 nm，病毒顆粒外覆含有脂質雙分子層的囊膜，鑲嵌有糖蛋白突起，內含有二十面體對稱結構核衣殼蛋白[7-8]。ATMUV基因組結構具有典型的黃病毒特征，均為不分節段單股正鏈RNA，基因組具有感染性。基因組大小約為11 kb，基因組5′端和3′端均含有高度保守的非編碼區（Untranslated regions，UTR），5′-UTR長為94 nt，包含一個帽狀“m7GpppAmpN2”結構，3′-UTR長為618 nt，不含多聚腺苷酸尾[7,9-12]。5′-UTR和3′-UTR之間含有一個大的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），編碼一個約3400 aa的多聚蛋白分子，被絲氨酸蛋白酶、弗林蛋白酶等酶解成10個蛋白，包含3種結構蛋白（Structural proteins）和7種非結構蛋白（Nonstructural proteins）。結構蛋白參與病毒感染時病毒粒子的吸附、膜融、病毒粒子組裝和出芽，非結構蛋白參與病毒的轉錄復制，同時調控宿主的抗病毒天然免疫[13-15]。

2 坦布蘇病毒結構蛋白與功能

衣殼蛋白C（Capsid protein，C）在蛋白翻譯過程中首先被合成，大小約為12 kDa，是多聚蛋白前體經氨肽酶酶解其第一個Met殘基而成的，是病毒組裝過程中的重要元件，含有較多帶正電的堿性氨基酸，與病毒基因組RNA結合組裝成核衣殼，避免基因組RNA遭受酶解；同時C蛋白還可誘導機體產生免疫應答反應[16]。試驗證明，C蛋白對病毒復制和成熟組裝同樣也發揮著至關重要的作用[17-20]。

前膜蛋白prM（Premembrane protein，prM）是成熟病毒顆粒中外膜蛋白（Membrance protein，M）的前體蛋白，分子量大小約為19 kDa。在病毒感染后期，病毒顆粒出芽釋放前通過弗林蛋白酶將prM糖蛋白切割成pr蛋白和成熟的M蛋白兩部分[21-22]，pr部分分泌到胞外，而M部分鑲嵌在細胞外膜磷酸脂質層中，同時與C蛋白和E蛋白緊密結合，參與病毒囊膜的組成，在ATMUV病毒粒子的成熟裝配和釋放過程中發揮作用[23]。

囊膜糖蛋白E（Envelope protein，E）是ATMUV最大的結構蛋白和主要膜蛋白，鑲嵌在病毒粒子囊膜表面，分子量約為54 kDa。作為宿主的重要保護性抗原，E蛋白能夠誘導動物發生特異性免疫應答，激發機體產生中和抗體。同時在病毒復制過程中，E蛋白對病毒吸附、膜融合以及受體結合等方面同樣也發揮著至關重要的作用，決定著病毒的細胞嗜性[24-25]。E蛋白屬于I型膜蛋白，包含三個結構域（Domain），根據其X射線晶體結構分析可分為DomainⅠ/Ⅱ/Ⅲ[26-28]，依次從氨基端到羧基端排列。DomainⅠ是位于E蛋白的中央結構域，含3個不連續的片段，呈β折疊桶狀結構，起到連接DomainⅡ和DomainⅢ的作用[29-30]。Domain I與ATMUV的細胞嗜性相關，同時也決定著病毒的毒力。DomainⅡ較為保守，形成延伸的指狀結構，參與E蛋白二聚體的形成，同時含有病毒融合肽，在病毒融合過程中，介導靶細胞的細胞膜與病毒囊膜的融合。Domain III是位于E蛋白的羧基端，結構上呈免疫球蛋白IgG結構，是重要的受體結合區域。大部分抗體可識別DomainⅢ上的抗原決定簇，其功能介導病毒與細胞膜表面受體結合過程，促進病毒進入宿主細胞[29,31-32]。邵周伍林等以pcDNA-E通過轉染DEF細胞后可導致受侵染的細胞發生細胞皺縮、崩解，核質濃縮、崩解等現象，提示E蛋白在誘導宿主細胞凋亡過程中發揮著重要的作用[33]。劉德建[34]研究表明，E蛋白糖基化對吸附、侵入和復制能力有一定的影響，消除E蛋白糖基化可降低病毒的裝配和釋放的效率，降低病毒致病性和神經毒性。趙冬敏等[35]利用免疫共沉淀試驗、病毒輔覆蛋白結合分析（VOPBA）以及LC-MSMS質譜分析鑒定等技術從鴨胚成纖維細胞膜蛋白中篩選出ATMUV受體結合蛋白HSP70，為抗ATMUV藥物設計提供思路。李晨曦[36]以純化的三株抗ATMUV E蛋白單克隆抗體1F3、3B6和1A5為固相篩選分子，按照結合、洗脫、擴增的順序篩選噬菌體隨機12肽庫，成功鑒定出DTMUV E蛋白的三個最小線性抗原表位221LNLPW226、374EVEPPFG380和87YAEYI91。通過對DTMUV E蛋白三維結構模擬分析發現，表位LNLPW和YAEYI位于E蛋白結構域Ⅱ，表位EVEPPFG位于E蛋白結構域Ⅲ，為黃病毒共享型的抗原表位。張琳等[37]篩選出ATMUV一個B細胞線性表位385LVGSGKGQI393（EP385），該表位具有良好的免疫原性，可為ATMUV疫苗的研制及診斷方法的建立提供基礎。凡玉芳[38]通過單克隆抗體精確鑒定出一個ATMUV B細胞線性表位1FSCLGMQ7，位于E蛋白Domain I結構域內。李小康等[39]應用噬菌體展示技術，篩選出與E蛋白特異性結合的多肽：HWSTRQGSTRWN（P3-12）和THRSWQGNSWYM（P8-12）。程冰花[40]通過酵母雙雜交從鴨胚成纖維細胞cDNA文庫中篩選出PRDX1、PRS7、MORC3、ANTX1等蛋白，為ATMUV受體研究豐富資料。劉龍[41]研究發現ATMUV E蛋白388位作S→R突變后神經毒力和神經侵襲力都明顯弱于野生親本株，表明E388是ATMUV E蛋白關鍵毒力位點。

3 坦布蘇病毒非結構蛋白與功能

NS1是一種高度保守的非結構蛋白，是胞外分泌的分泌型蛋白，其分子量大小為40 kDa，可粘附于感染的細胞外表面表達，并常以二聚體的形式分泌于胞外，利用NS1建立的ELISA檢測方法可適用于早期感染的診斷[42]。NS1是一種多效應蛋白，不僅在病毒感染過程中的早期復制發揮著重要的作用，而且也可以與其它非結構蛋白相互協作發揮效應[43]。該蛋白是病毒復制過程中所產生的重要抗原，可誘導機體產生細胞免疫和非中和性保護力。由于NS1蛋白不是病毒粒子的成分，同時具有可溶性補體結合活性，可誘導產生非中和性保護效應[44-45]。近年來，有關TMUV-NS1研究發現，NS1蛋白可與RLRs信號通路中關鍵蛋白MAVS特異性結合，進而抑制I型干擾素產生以拮抗天然免疫應答[46]。王振忠[12]研究表明，NS1蛋白的表達能夠下調RPS7和MDM2的轉錄水平，進而導致P53 mRNA的表達水平升高，可能引起相應蛋白表達水平升高，最終導致細胞凋亡的發生。

非結構蛋白NS2以兩種均為疏水性蛋白NS2A和NS2B的形式出現。NS2A和NS2B是在病毒復制過程中被進一步切割而成的，二者均表現為疏水性，其分子量較小，分別為17 kDa和13 kDa。其中NS2A在病毒組裝方面起重要的作用[47-49]，并且NS2A還可與NS3和NS2B相互作用[48,50]。陳舜等[51]以IFN預處理DEF可有效控制后續ATMUV的增殖，但對已經感染ATMUV的DEF細胞添加IFN則無法控制ATMUV的增殖。同時，經體外試驗發現ATMUV可顯著促進混合感染的鴨瘟病毒增殖。提示ATMUV能干擾IFN的抗病毒效果，明確NS2A經由阻止STAT磷酸化而抑制抗病毒IFN信號通路，從而發揮免疫逃逸功能而促進自身持續增殖。NS2B蛋白的羧基端含有與NS3互作的結構，相互作用而構成NS2B/NS3蛋白酶復合體，對非結構蛋白前體的切割加工過程中起重要作用，其作用位點位于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A和NS5等非結構蛋白之間的連接處。另外，NS2B還介導NS3的膜固定，并通過NS3富集NS5到膜上，形成病毒RNA復制體[52]。

NS3是一個具有多種功能的蛋白，分子量為69 kDa。其N端為絲氨酸蛋白酶結構域，C端為RNA解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA 5′三磷酸酶結構域，具有絲氨酸蛋白酶、核苷酸三磷酸酶和RNA解旋酶等活性[53]。NS3蛋白不僅可獨立調控病毒RNA復制、合成以及蛋白加工，也可與NS5蛋白形成復合物協同參與這一過程[54]。

NS4以NS4A和NS4B兩種蛋白形式存在，其分子質量分別約為28 kDa和14 kDa。NS4A蛋白的作用較為廣泛，在蛋白翻譯后的加工過程中，NS4A與NS3蛋白酶常膠合在一起，借此能穩定NS3絲氨酸蛋白酶與其它非結構蛋白間的相互作用，提高了NS3絲氨酸蛋白酶的切割效能[12]。同時，NS4A可通過誘導自噬以防止細胞的死亡，進而對病毒的復制起到促進作用[55]；此外，NS4A還可與波形蛋白相互作用，參與病毒復制復合體的構成[56]。NS4B存在3個跨膜結構域，在功能上與NS4A相似，都可抑制干擾素信號通路以拮抗宿主免疫應答[57]。

NS5蛋白是ATMUV基因組編碼最保守的蛋白，也是最大的非結構蛋白，分子量為100 kDa。常利用其編碼基因3′端核苷酸對黃病毒科病毒成員進行分類[58]。NS5蛋白的C端存在RNA依賴性RNA聚合酶結構域，參與黃病毒基因組的復制；N端存在甲基轉移酶（Methyltransferase，MTase）結構域。同時，NS5蛋白還具有RNA加帽活性、鳥苷酸轉移酶（Guanylyltransferase，GTase）和核定位功能。此外，NS5蛋白能夠協同參與宿主內多種反應機制，拮抗宿主的天然免疫反應。張吉[59]研究表明，NS5蛋白發揮關鍵抑制作用，ATMUV-NS5通過阻礙STATs核移位過程，進而拮抗IFN-I信號轉導，從而阻礙下游JAK-STAT信號通路拮抗IFN-I信號轉導過程。