miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達及作用機制

尹周亮 張波 張健 徐建峰

食管癌是世界第六大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第四大常見原因[1]，其中超過90%為食管鱗狀細胞癌[2-3]。目前食管癌患者的預后仍不理想，中位生存時間僅為1.5 年，5 年生存率不到10%[4]。尋找食管癌的生物標志物和開發新的基因治療，對降低食管癌患者死亡率具有重要意義。miRNA 作為一種轉錄后調控因子，可通過特異性結合靶mRNA 減少mRNA 翻譯或降低靶mRNA 表達[5-7]。目前，miRNA 已被證實在腫瘤中存在差異表達，且參與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。研究發現，miR-196b-5p 參與某些腫瘤的發生、發展，或可作為腫瘤生物標志物[8-9]。Shao 等[9]發現miR-196b-5p 在胃癌組織中高表達，且調控胃癌細胞的增殖和侵襲。另一研究顯示，在胃癌患者的血清中，miR-196b-5p 同樣存在高表達，且對胃癌診斷及預測淋巴結轉移均具有一定的價值[10]。然而，目前關于miR-196b-5p 與食管癌的關系鮮有報道。基于此，本研究探討miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達情況，評估miR-196b-5p 作為食管鱗癌潛在生物標志物的可能性，并進一步分析其作用機制，以期為miR-196b-5p 作為食管鱗癌生物標志物和治療靶點提供理論支持。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2015 至2019 年浙江省臺州醫院收治的病理學檢查確診為食管鱗癌的24 例患者的癌組織及相應癌旁（距離腫瘤≥2 cm）正常組織標本，組織標本均由中心實驗室規范保存。24 例食管鱗癌組織標本中男19 例，女5 例；年齡＜60 歲17 例，≥60 歲7例；腫瘤位置：食管近段～中段15 例，遠段9 例；T 分期：T1～2期12 例，T3～4期12 例；N 分期：N0期14 例，Nx期10 例。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 組織標本miR-196b-5p 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。取適量的組織放入無酶EP 管后上機研磨，在研磨后的組織中加入1 ml Trizol（美國賽默飛公司），嚴格按照反轉錄試劑盒（美國賽默飛公司）說明書要求提取總RNA。將2×Master Mix、50×ROX Reference Dye、引物（上海生物工程公司）、模板完全溶解，依照PCR 試劑（上海吉瑪公司）說明書配制反應體系，設置3 個復孔進行PCR 擴增，結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。所有miRNA 表達數據采用log5（x）進行標準化處理。miR-196b-5p 上游引物：3'-TAGGTAGTTTCCTGTTGTTGGG-5'，下游引物：3'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-5'；內參U6 上游引物：3'-CTCGCTTCGGCAGCACA-5'，下游引物：3'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5'。

1.3 癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）和基因表達匯編（gene expression omnibus，GEO）數據驗證 從TCGA 數據庫（https://cancergenome.nih.gov/）中下載食管鱗癌高通量基因測序數據和臨床數據集，共95 例食管鱗癌癌組織和13 例癌旁正常組織的miRNA 表達數據納入本研究。所有miRNA 表達數據采用log2（x）進行標準化處理。從GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中下載GSE43732 數據集，共115 例食管鱗癌組織和45 例癌旁正常組織的miRNA表達數據納入本研究。所有miRNA 表達數據采用2n進行標準化處理。以上所有數據均來自有效信息，不包括遺失的數據。

1.4 患者分組定義 基于24 例食管鱗癌患者的miRNA 數據，定義癌組織中miR-196b-5p 表達水平高于截斷值的患者為高表達患者，反之定義為低表達患者，以進行后續生存分析。另基于TCGA 完整的RNA、miRNA 和臨床數據，按食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 表達水平從低到高對食管鱗癌患者進行排序，定義前1/3 患者為miR-196b-5p 低表達患者，后1/3 患者為miR-196b-5p 高表達患者，以進行后續差異基因的富集分析。

1.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析 利用R 包“limma”對miR-196b-5p 高表達和低表達患者進行差異基因篩選，設置閾值log 倍數變化（fold change，FC）＞0.5 且錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.1。利用DAVID 在線生物信息分析軟件（https://david.ncifcrf.gov/）對miR-196b-5p 相關差異基因進行KEGG通路分析，P＜0.05 被認為富集顯著。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U 檢驗。采用GraphPad 軟件繪制ROC 曲線；生存分析的最佳截斷值來自X-tile 軟件[11]分析結果；通過Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，預后比較采用log-rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-196b-5p 表達水平比較 qRT-PCR 檢測結果、TCGA數據庫和GEO 數據庫中食管鱗癌患者癌組織miR-196b-5p 表達水平均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統計學意義（均P＜0.01），見表1。

2.2 miR-196b-5p 診斷食管鱗癌的效能 根據本研究24 例食管鱗癌癌組織標本qRT-PCR 檢測結果計算，miR-196b-5p 水平診斷食管鱗癌的靈敏度為0.79，特異度為0.92，最佳截斷值為1.542，AUC 為0.891（95%CI：0.767～0.962）（P＜0.01）；根據TCGA 數據計算，靈敏度為0.86，特異度為0.85，最佳截斷值為5.310，AUC 為0.832（95%CI：0.748～0.897）（P＜0.01）；根據GEO 數據計算，靈敏度為0.89，特異度為0.96，最佳截斷值為0.012，AUC 為0.946（95%CI：0.900～0.975）（P＜0.01），見圖1。

2.3 不同臨床特征食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達水平比較 本研究24 例食管鱗癌患者中，T3～4期患者癌組織中miR-196b-5p 表達水平高于T1～2期患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；但不同性別、年齡、腫瘤位置和N 分期患者癌組織miR-196b-5p表達水平比較差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表2。

2.4 食管鱗癌癌組織miR-196b-5p 高表達與低表達患者生存情況比較 X-tile 軟件顯示進行生存分析時miR-196b-5p 表達水平的最佳截斷值為1.898。本研究24 例食管鱗癌患者中，13 例miR-196b-5p 低表達（≤1.898）患者3 年生存率為55.3%，明顯高于11 例miR-196b-5p 高表達（＞1.898）患者的0.0%，差異有統計學意義（χ2=4.412，P=0.036），見圖2。

2.5 KEGG 富集分析miR-196b-5p 在食管鱗癌中的信號通路 通過R 包“limma”共篩選出173 個差異基因，對這些差異基因進行KEGG 富集分析顯示，差異基因顯著富集于有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Wnt、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等多條通路（均P＜0.05）。前10 項通路富集見表3。

3 討論

食管癌患者無論是局部轉移還是遠處轉移，其預后通常較差。因此，早期篩選食管癌患者并進行有效的治療對于預后具有重要意義。本研究中，筆者探討了miR-196b-5p 在食管鱗癌癌組織中的表達情況，并進一步分析其可能參與的信號通路。

本研究結果顯示，miR-196b-5p 與食管鱗癌的發生關系密切。與癌旁正常組織相比，食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達水平明顯上調，ROC 曲線分析結果顯示miR-196b-5p 預測食管鱗癌的AUC 值為0.891，具備較高的靈敏度和特異度。這一結論得到TCGA 和GEO 數據分析結果的支持。同時，本研究結果還顯示T3～4期食管鱗癌患者癌組織中miR-196b-5p 表達水平高于T1～2期患者，提示miR-196b-5p 與食管鱗癌進展有關。生存分析結果顯示食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 高表達患者的預后較低表達患者差。另外，本研究顯示miR-196b-5p 可能通過參與MAPK、Wnt、PI3K/Akt 等多條信號通路的調控，從而影響食管鱗癌的發生和發展。

表1 食管鱗癌患者癌組織與癌旁正常組織miR-196b-5p 表達水平比較

圖1 miR-196b-5p 診斷食管鱗癌的ROC 曲線（TCGA 為癌癥基因組圖譜；GEO 為基因表達匯編）

表2 不同臨床特征食管鱗癌患者癌組織miR-196b-5p 表達水平比較

圖2 食管鱗癌組織miR-196b-5p 高表達與低表達患者生存曲線比較

表3 前10 項KEGG 通路富集結果

研究顯示miR-196b-5p 在胃癌[9]、結直腸癌[8]、非小細胞癌[12]和乳腺癌[13]等多種腫瘤中表達失調。已有研究表明，miR-196b-5p 在胃癌患者癌組織和外周血清中均顯著上調，可作為胃癌診斷的潛在生物標志物和淋巴結轉移的預測因子，具有重要的臨床價值[9-10]。與此同時，Ren 等[8]和Xu 等[14]發現miR-196b-5p 在結直腸癌患者癌組織和外周血清中均存在高表達，在結直腸癌診斷中具有一定的臨床價值，且高表達的miR-196b-5p 與淋巴結浸潤、分化程度及淋巴結轉移有關。上述研究顯示，miR-196b-5p 可作為某些特定腫瘤診斷的潛在生物標志物。

研究發現miR-196b-5p 可通過調節靶基因從而調控胃癌[9]、結直腸癌[15]、口腔癌[16]等多種腫瘤細胞的遷移和侵襲。盡管如此，miR-196b-5p 對信號通路的調控作用卻鮮有研究。Li 等[17]研究表明，miR-196b-5p 可通過PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路調控胃癌細胞的增殖和侵襲。PI3K/Akt 信號通路在過去被發現參與包括食管鱗癌在內的多種腫瘤細胞的凋亡、增殖和轉移[18-19]。筆者過去的一項研究表明，miR-30b-5p 可通過PI3K/Akt 信號通路調控食管鱗癌細胞的遷移和侵襲[20]。另外，MAPK 和Wnt 等信號通路也被證實與食管鱗癌關系密切[21-22]。

綜上所述，miR-196b-5p 在食管鱗癌的發生中起著重要作用。食管鱗癌癌組織中miR-196b-5p 表達水平明顯高于癌旁正常組織，或可作為食管鱗癌篩選的潛在生物標志物。miR-196b-5p 可能通過參與調控多條信號通路，在食管鱗癌發生中起致癌作用。本研究也存在一些不足，如缺少食管鱗癌患者外周血的檢測以進一步明確miR-196b-5p 作為篩選因子的潛能；信號通路方面仍需細胞、動物實驗進一步驗證。