N-乙酰半胱氨酸對(duì)感染性休克小鼠肺損傷保護(hù)作用的研究

黃曉軍 陳茜圓 任卓超 金興

感染性休克患者平均死亡率高達(dá)42.9%，是重癥患者的首要致死原因[1-2]。感染性休克過程中，誘發(fā)大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）和炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征的發(fā)生，出現(xiàn)多器官功能不全甚至多系統(tǒng)器官功能衰竭[3]。感染性休克會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，發(fā)生急性呼吸衰竭。大量研究顯示，氧化應(yīng)激在感染性休克發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用[4-6]。N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）前體，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗自由基作用[7-8]。本研究擬評(píng)價(jià)NAC 能否通過抗氧化應(yīng)激、抗炎作用，起到減輕感染性休克小鼠肺損傷的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8 周雄性SPF 級(jí)C57BL/6 小鼠30只，由江蘇集萃藥康生物公司提供。在屏障環(huán)境下飼養(yǎng)，室溫20～25 ℃，12 h 光照/12 h 黑暗交替，均自由攝食攝水。操作均嚴(yán)格遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）（L2880）、NAC（A7250）均購自美國Sigma 公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）試劑盒（A003-1-2）購自南京建成生物工程研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）試劑盒（KGT001100-2）、TNF-α 試劑盒（KGEMC102a-1）及IL-6 試劑盒（KGEMC004-1）均購自南京凱基生物科技公司。

1.3 動(dòng)物分組及模型制作 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為對(duì)照組、模型組和NAC 干預(yù)組3 組，每組10 只。模型組和NAC 干預(yù)組腹腔注射LPS（25 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液）制備內(nèi)毒素誘發(fā)感染性休克模型[9]，對(duì)照組則腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉注射液。NAC 干預(yù)組注射LPS 后即刻腹腔注射NAC（300 mg/kg，溶于0.2 ml 0.9%氯化鈉注射液）[10]，而對(duì)照組和模型組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液。6 h 后處死小鼠，并立即取出肺組織。

1.4 肺組織形態(tài)學(xué)變化觀察 取部分右肺組織，10%甲醛固定后，經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯處理后，常規(guī)石蠟包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化。根據(jù)肺泡腔及間隔炎癥細(xì)胞滲出情況（0～3 分）、肺泡間隔增寬情況（0～3 分）、肺泡腔出血情況（0～3 分）、肺泡纖維蛋白滲出情況（0～3 分）進(jìn)行評(píng)分，4 項(xiàng)總分為肺組織病理損傷評(píng)分[11-12]。

1.5 肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量、SOD 活性測定 取左肺組織制備10%組織勻漿，按照試劑盒說明書，采用ELISA 法測定肺組織中炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α 水平，采用比色法測定肺組織中氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 含量和抗氧化酶SOD 活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)，兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下，對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無增寬，可見少量炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺組織損傷明顯，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)及肺泡腔可見大量炎性細(xì)胞；NAC 干預(yù)組相對(duì)模型組肺損傷程度減輕，見圖1。對(duì)照組、模型組和NAC 干預(yù)組肺組織病理損傷評(píng)分分別為（1.07±0.30）、（7.31±1.10）和（5.57±0.88）分，3 組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組比較，模型組和NAC 干預(yù)組肺組織病理損傷評(píng)分均升高（均P＜0.05）；與模型組比較，NAC 干預(yù)組肺組織病理損傷評(píng)分降低（P＜0.05）。

2.2 3 組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比較 與對(duì)照組比較，模型組和NAC 干預(yù)組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均升高，SOD 活性降低（均P＜0.05）；與模型組比較，NAC 干預(yù)組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低，SOD 活性升高（均P＜0.05），見表1。

3 討論

本研究以腹腔注射LPS 制備內(nèi)毒素誘發(fā)感染性休克模型，該模型已很成熟，筆者也在前期的研究中反復(fù)證實(shí)了該模型的可靠性。本研究通過NAC 干預(yù)感染性休克小鼠模型，結(jié)果表明，NAC 可減輕LPS 誘導(dǎo)的感染性休克小鼠肺損傷的嚴(yán)重程度，可使肺組織中SOD 活性升高，IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量均降低。SOD 是一種抗氧化酶，它可以清除氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的過多ROS，對(duì)機(jī)體起到非常重要的保護(hù)作用。MDA 是氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的高細(xì)胞毒性物質(zhì)，MDA 對(duì)機(jī)體的危害極大，它與蛋白質(zhì)、酶發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而影響其功能。說明NAC 可以通過其抗氧化和抗炎作用，起到保護(hù)感染性休克小鼠肺損傷的作用。

圖1 3 組小鼠肺組織病理切片所見[a：對(duì)照組；b：模型組；c：N-乙酰半胱氨酸（NAC）干預(yù)組；HE 染色，×200]

表1 3 組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 水平、MDA 含量和SOD 活性比較

NAC 作為祛痰劑應(yīng)用于臨床多年。近年研究表明，NAC 具有很強(qiáng)的抗氧化、去除自由基作用。NAC 的抗氧化應(yīng)激作用在國內(nèi)外許多研究中均得到了證實(shí)。Hegab 等[13]在“NAC 和金雀異黃素對(duì)吲哚美辛誘導(dǎo)的胃損傷模型的保護(hù)作用”的研究中發(fā)現(xiàn)，NAC 預(yù)處理可明顯改善潰瘍指數(shù)，增加NO 水平和SOD 活性，同時(shí)明顯降低MDA、TNF-α 水平和髓過氧化物酶（MPO）活性。Maheswari 等[14]在“評(píng)估NAC 對(duì)卡馬西平引起的肝毒性的肝保護(hù)作用”研究中觀察到，NAC 可使GSH 升高，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平降低，并逆轉(zhuǎn)卡馬西平誘導(dǎo)的組織病理學(xué)異常。Hu 等[15]研究表明，NAC 可降低非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠骨髓中的ROS 水平。

感染性休克是重癥患者死亡的首要原因，雖然現(xiàn)今的醫(yī)療手段已有很大的提高，但其死亡率仍居高不下。研究表明，感染性休克中機(jī)體產(chǎn)生的過多ROS 在全身炎癥反應(yīng)綜合征、多器官功能不全的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用，因此認(rèn)為感染性休克是一種高氧化應(yīng)激疾病[3]。肺是機(jī)體通氣和氧氣交換器官，肺組織氧含量高，因此肺臟也是最容易受到ROS 損害的臟器。感染性休克會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷，發(fā)生急性呼吸衰竭。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor2，Nrf2）在機(jī)體抗氧化應(yīng)激中起到重要的保護(hù)作用。正常生理情況下，Nrf2 同胞質(zhì)蛋白伴侶分子Keap1 偶聯(lián)，Nrf2 的生物活性受到抑制；當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生大量ROS，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2 會(huì)從Keap1 解離出來并進(jìn)入細(xì)胞核，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件調(diào)控的相關(guān)抗氧化和抗炎基因的表達(dá)，從而起到對(duì)機(jī)體的保護(hù)[16-17]。NAC 對(duì)感染性休克小鼠的肺損傷保護(hù)作用可能與其激活Nrf2 有關(guān)[18-19]，NAC 通過上調(diào)Nrf2，激活相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，使肺組織中抗氧化指標(biāo)升高，氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)和炎癥介質(zhì)水平降低，從而起到減輕感染性休克小鼠肺損傷的作用。

綜上所述，NAC 可通過抗氧化應(yīng)激及清除氧自由基相關(guān)物質(zhì)，從而對(duì)內(nèi)毒素誘發(fā)感染性休克小鼠肺損傷起到保護(hù)性作用。但感染性休克是一種全身性疾病，可以導(dǎo)致肺、肝、腎、心臟等多臟器功能異常。NAC 能否對(duì)其他臟器產(chǎn)生保護(hù)作用、改善感染性休克總體預(yù)后有待進(jìn)一步研究；如何優(yōu)化NAC 的用藥方式有待進(jìn)一步研究和探討。