日糧不同NDF/NFC 水平對周歲后荷斯坦奶牛生產性能、營養物質消化率、瘤胃發酵特征和甲烷排放的影響

董利鋒，楊修竹，高彥華，李斌昌，王貝，刁其玉

（1.中國農業科學院飼料研究所，反芻動物及其幼畜營養代謝中美聯合研究中心，中國農業科學院-國際熱帶農業研究中心農業可持續發展聯合實驗室，北京100081；2.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都610041；3.甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅 蘭州730070；4.塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾843300）

反芻動物憑借其龐大的瘤胃微生物體系能夠高效利用纖維類物質含量豐富的粗飼料，并將其轉化為動物性產品。在瘤胃微生物發酵過程中，產甲烷菌利用微生物降解過程中所產生的底物（如H2）生成甲烷。作為瘤胃有機物無氧酵解的必然副產物之一，甲烷氣體排放所損失的能量可占到飼料總能攝入量的2.7%～9.8%［1］。以往的研究發現，增加日糧中粗纖維水平可顯著降低反芻動物的干物質采食量和營養物質消化率，會促進瘤胃發酵甲烷的產生［2］。Moorby 等［3］發現將荷斯坦泌乳奶牛日糧中中性洗滌纖維（neutral detergent fiber，NDF）含量從41%增加到55%時，其干物質采食量和中性洗滌纖維采食量分別下降了56.8%和18.3%。周艷等［4］在生長期杜寒雜交肉羊上的結果發現，當飼料中NDF 含量增加時，干物質的表觀消化率從61.34%降低至51.17%，粗蛋白質的表觀消化率從47.47%下降至30.95%，而甲烷產量從36.07 L·d?1增加至79.32 L·d?1。原因可能是瘤胃內食糜的消化速度和流通速率受到了日糧結構的影響，從而造成瘤胃甲烷排放量的改變。除此之外，畜牧養殖業產生的甲烷是人為排放甲烷的重要來源之一，是造成全球性極端氣候變化的主要貢獻者。因此，適當減少反芻動物甲烷的生成和排放具有經濟和環境的雙重效益。

作為奶牛種群中的主體，泌乳奶牛在不同生產模式和日糧條件下的瘤胃甲烷排放特征已經得到較為廣泛的研究和證明。王貝等［5?7］系統研究了荷斯坦泌乳奶牛在不同泌乳階段的瘤胃甲烷排放規律，結果發現泌乳中期的甲烷排放量最高（399.8 g·d?1），其次是泌乳后期（395.61 g·d?1）和泌乳早期（391.86 g·d?1）。Jonker 等［8］發現荷斯坦泌乳奶牛在不同放牧條件下瘤胃甲烷排放量存在差異，其中奶牛在燕麥草（Lolium perenne）和白三葉草（Trifolium repens）牧場中甲烷排放量為402 g·d?1。郜宇洋［9］采用六氟化硫示蹤技術研究了不同生長階段西門塔爾雜交肉牛營養物質利用和瘤胃甲烷排放，發現隨著生長階段的遞增，甲烷排放量逐漸增加。近期的研究發現，與飼喂50%粗飼料的荷斯坦后備奶牛相比，飼喂70%粗飼料的奶牛的瘤胃甲烷排放量顯著增加了20.8%，甲烷轉化因子增加了43.9%［10］。Jiao 等［11］研究了舍飼條件下荷斯坦后備奶牛瘤胃甲烷的排放特征，發現生理階段（6、12、18 和22 月齡）和性別（公母）能夠顯著影響甲烷排放量。但是，目前我國關于后備奶牛瘤胃甲烷排放特征的研究較少，尤其是不同日糧營養組成和結構條件下后備奶牛的生長性能、營養物質消化率、瘤胃發酵特征以及甲烷排放的研究還存在空白，仍缺乏系統性的甲烷排放規律和甲烷轉化因子的研究。因此，本試驗通過研究不同日糧中性洗滌纖維/非纖維性碳水化合物（neutral detergent fiber/non-fibrous carbohydrate，NDF/NFC）水平對周歲后荷斯坦奶牛生產性能、營養物質表觀消化率、瘤胃發酵指標及甲烷產量的影響，并在此基礎上建立瘤胃甲烷排放預測模型，旨在獲得我國生產模型下的甲烷排放規律和甲烷轉化因子，為提高奶牛能量利用效率和探索減排策略提供科學依據和支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

本試驗于2018 年9?10 月在北京市房山區趙營村中加永宏奶牛場完成。

1.2 試驗設計與管理

試驗選用45 頭體重為（425±35.2）kg，月齡為（14.5±0.34）體況健康的中國荷斯坦后備奶牛。根據月齡、體重相近的原則按照單因素實驗設計將動物隨機分為3 個處理組：低NDF/NFC 組（NDF/NFC=0.60；精料比例為50%，干物質基礎）、中NDF/NFC組（NDF/NFC=0.75；精料比例為40%）以及高NDF/NFC 組（NDF/NFC=0.90；精 飼 料 比 例 為30%）。按照中國奶牛飼養標準［12］配置后備奶牛的日糧，日糧組成及營養成分含量見表1。試驗預飼期為14 d，正式試驗期為56 d，包括35 d 的生長試驗，7 d 的消化代謝試驗以及14 d 的氣體代謝試驗。試驗奶牛采用拴系式飼養，每天喂料2 次（06：00 和18：00），日剩料量控制在5%。自由飲水，定期清理水槽，保證清潔飲水。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能測定 干物質采食量的測定。分別于生長試驗的第1、3 和5 周連續4 d 記錄每天每頭奶牛的投料量和剩料量，計算每頭奶牛的日采食量。根據采食量記錄期間采集的飼料樣品的干物質含量來計算奶牛每天的干物質采食量。

體重和平均日增重的測定。分別于生長試驗的第1、21 和35 天晨飼前進行稱重，并計算平均日增重。

1.3.2 營養物質表觀消化率測定 采用鹽酸不溶灰分法（acid insoluble ash）測定后備奶牛的營養物質表觀消化率［13］。在正式試驗期的第36～42 天分批次連續收集糞便樣品7 d。采樣時按照每100 g 鮮樣加10 mL 鹽酸（10%濃度）防止氮的揮發。經65 ℃烘箱中烘干后密封保存。

1.3.3 瘤胃液采集與發酵指標測定 于正式試驗結束前3 d，從每個處理組中隨機選取4 頭動物，晨飼前采用口腔導管的方式采集瘤胃液樣品［14］。采集的瘤胃液用滅菌的4 層紗布過濾后分裝于10 mL 的離心管中用于揮發性脂肪酸和氨態氮濃度測定。另取10 mL 的瘤胃液進行pH 值測定。

表1 日糧基本組成及營養成分含量Table 1 The composition and nutrient contents of experi?mental diet

參照Broderick 等［15］的水楊酸鈉?次氯酸鈉比色法測定瘤胃液氨態氮（NH3?N）含量。采用氣相色譜儀（6890N，Agilent，美國）測定揮發性脂肪酸的濃度。色譜柱為HP19091N?213 型毛細管柱，進樣口溫度為200 ℃，載氣為高純氮氣，流量為2.0 mL·min?1。火焰氫離子檢測器的溫度為250 ℃［16］。酸堿度采用便攜式pH 計（ST 300，Ohaus，美國）測定。

1.3.4 瘤胃甲烷排放測定 采用六氟化硫示蹤技術測定荷斯坦后備奶牛的瘤胃甲烷排放量［17］。在氣體代謝試驗開始前3 d，從每個處理組中隨機選取5 頭后備奶牛，采用獸用投藥槍（A28568N，科立博，武漢）將六氟化硫滲透管投入到瘤胃內，并連接氣體采集管路、集氣罐和背部襯墊，以便讓動物充分適應設備。本試驗中六氟化硫滲透管的滲透速率范圍為3.42～3.85 mg·d?1，平均滲透速率為3.35 mg·d?1。氣體采集管路中的流速控制為0.45 mL·min?1，集氣罐體積為4.5 L。

氣體代謝試驗期間，連續收集每個處理組中5 頭動物每天24 h 的氣體產量（08：00 至次日08：00）。同時，選取5 個采氣管路和集氣罐放置于牛舍內對背景氣體進行采集。氣體樣品采集結束后對集氣瓶內壓力進行測定，大于?40 kPa 時即為采樣成功。采用氣相色譜儀（GC-126，上海儀電分析儀器有限公司，上海）對每日采集的氣體樣品進行測定。其中氫火焰離子檢測器和電子捕獲檢測器的檢測溫度分別為150 和300 ℃。六氟化硫和甲烷標準氣體的濃度分別為6.5×10?8和7.1×10?3g·m?3，填充氣為高純氮氣。采用單點校正法測定六氟化硫含量，并計算甲烷濃度，單位以g·d?1表示。

1.3.5 飼料樣品采集與分析 于正試期的第12～15 天連續收集各處理組的飼料樣品，充分混合后進行常規營養價值成分的分析。依照張麗英［18］的方法對飼料樣品中的有機物、粗蛋白質、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、粗脂肪、粗灰分、總能、鈣和磷進行測定，并計算日糧中NFC 的含量。同時，采用相同方法測定糞樣中粗蛋白質、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量，計算營養物質的表觀消化率。

1.4 統計分析

采用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，采用Duncan 氏法進行差異顯著性分析。試驗結果以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛生長性能的影響

如表2 所示，3 組動物的月齡和體重沒有顯著差異（P>0.05）。低NDF/NFC 組后備奶牛的干物質采食量、有機物采食量和總能攝入量顯著高于另外兩個處理組（P<0.05）。低NDF/NFC 組和中NDF/NFC 組動物的平均日增重沒有顯著差異（P>0.05），但顯著高于高NDF/NFC 處理組（P<0.05）。

2.2 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛營養物質表觀消化率的影響

如圖1 所示，在消化代謝試驗中，低NDF/NFC 組的干物質、粗蛋白質和酸性洗滌纖維表觀消化率顯著高于中NDF/NFC 和高NDF/NFC 組（P<0.05），但后兩個處理組在該指標上沒有顯著差異（P>0.05）。對于中性洗滌纖維表觀消化率來說，低NDF/NFC 和中NDF/NFC 組之間沒有顯著差異（P>0.05），但顯著高于高NDF/NFC 組（P<0.05）。

2.3 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛瘤胃發酵指標的影響

如表3 所示，3 個處理組中試驗動物的瘤胃pH 值之間沒有顯著差異（P<0.05）。但是，隨著日糧NDF/NFC水平的增加，瘤胃內總揮發性脂肪酸的濃度、乙酸相對含量以及乙酸/丙酸的比例顯著增加（P<0.05），而丙酸和丁酸的相對含量顯著降低（P<0.05）。此外，戊酸、異戊酸和異丁酸的含量在3 個處理組中沒有顯著差異（P>0.05）。

2.4 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛瘤胃甲烷排放的影響

如表4 所示，甲烷的排放量與日糧中NDF/NFC 水平緊密相關，高的NDF/NFC 水平，甲烷排放就高（P<0.05）。高NDF/NFC 組后備奶牛的單位代謝體重、單位干物質采食量、單位有機物采食量、單位中性洗滌纖維采食量的甲烷排放量顯著高于另外兩個處理組（P<0.05）。單位總能攝入量的甲烷能排放量也隨著日糧NDF/NFC 水平的增加而顯著增加（P<0.05）。

表2 日糧不同NDF/NFC 水平對荷斯坦后備奶牛生產性能的影響Table 2 Effects of dietary NDF/NFC contents on the growth performance of Holstein heifers

圖1 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛營養物質表觀消化率的影響Fig.1 Effects of different dietary NDF/NFC levels on nutrient digestibility of heifers

2.5 后備奶牛瘤胃甲烷排放預測模型

如表5 所示，基于動物體重、干物質采食量、中性洗滌纖維含量以及非纖維性碳水化合物含量/中性洗滌纖維含量分別建立了瘤胃甲烷產量的預測模型。其中基于干物質采食量建立的甲烷預測模型的決定系數最高，為0.74。另外，基于總能攝入量、中性洗滌纖維采食量、非纖維性碳水化合物采食量也建立了甲烷能產量的預測模型。基于干物質采食量和中性洗滌纖維采食量建立的二元一次預測模型提高了方程的決定系數，達到了0.77。

表3 日糧不同NDF/NFC 水平對荷斯坦后備奶牛瘤胃發酵指標的影響Table 3 Effects of dietary NDF/NFC contents on the ruminal fermentation parameters of Holstein heifers

表4 日糧不同NDF/NFC 水平對荷斯坦后備奶牛瘤胃甲烷產量的影響Table 4 Effects of dietary NDF/NFC contents on the enteric methane emissions of Holstein heifers

表5 基于生產性能和營養物質攝入量的瘤胃甲烷產量預測模型Table 5 Prediction equations of enteric methane emissions based on production performance，nutrient content and intake pa?rameters

3 討論

3.1 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛生長性能的影響

后備牛的生長性能與日糧營養水平密切相關。本研究發現提高日糧中可溶性碳水化合物的含量可顯著提高動物的干物質采食量和日增重，該結論與王貝等［7］的結果一致，主要原因是日糧中非纖維性碳水化合物如淀粉含量增加，經瘤胃微生物發酵之后，動物可獲得更多的能量，因此能夠提高動物的日增重。此外，淀粉等可溶性碳水化合物增加，使食糜在瘤胃內的流通速度增加，停留時間減少，因此動物通過增加采食次數和采食量來提高飽腹感。在本試驗中，與高NDF/NFC 組的后備奶牛相比，低NDF/NFC 的干物質采食量和非纖維性碳水化合物采食量分別提高了6.99%和7.84%，平均日增重顯著提高了20.7%。結果表明提高日糧中的非纖維性碳水化合物比例可以提高生長性能，有利于動物生長發育。

3.2 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛營養物質表觀消化率的影響

日糧中NDF/NFC 的比例可在一定程度上反映出飼料中難降解物質和易消化物質的組成，影響其在瘤胃內的降解速率、降解產物，并進一步改變瘤胃的發酵模式。因此，日糧中纖維類物質和非纖維性碳水化合物能夠顯著改變營養物質在瘤胃內的表觀消化率。以往的研究表明，當日糧精料水平低于70%時，增加日糧精料含量總能提高干物質和有機物的表觀消化率［4］。究其原因，可能是隨著日糧中精料比例增加，可溶性碳水化合物含量增加，發酵產生的營養物質可為瘤胃微生物提供更多的能量，增加其消化代謝營養物質的活性。本試驗中，當后備奶牛飼喂低NDF/NFC 日糧時，其干物質的表觀消化率比高NDF/NFC 組提高了10.1%，而中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維分別提高了4.9%和8.3%，達到了顯著水平。該結論與周艷等［4］在生長期母羊上的結果一致。以往的研究認為精飼料比例能夠顯著影響瘤胃微生物對氮的利用效率，而適度提高日糧淀粉含量可促進蛋白質的消化，并增強瘤胃微生物對含氮物質的利用［19］。本試驗中降低日糧中NDF/NFC 比例時，粗蛋白質的表觀消化率最多提高了9.5%，該結論與以上研究結果一致。

3.3 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛瘤胃發酵指標的影響

日糧結構和組成是影響瘤胃發酵特征的重要因素之一，其中瘤胃液pH 值能夠反映瘤胃內有機酸和氨態氮等堿性物質的動態平衡關系。在本試驗中，3 個處理組中瘤胃液的pH 值之間沒有顯著差異，表明本試驗中日糧對瘤胃酸堿度的影響較小。與以往的研究結果一致，3 個處理組瘤胃液的平均pH 值為6.45，在正常的pH 值范圍之內（5.5～7.5）［20］。瘤胃液中氨態氮是食糜中含氮類物質代謝的重要產物，也是瘤胃微生物蛋白質合成的主要氮源。有研究表明，瘤胃液中氨態氮的含量與日糧中粗蛋白質含量呈正相關關系；但提高日糧中碳水化合物水平會抑制瘤胃微生物對蛋白質的降解，從而造成氨態氮含量的累積［21］。在本試驗中，將周歲后荷斯坦后備奶牛日糧NDF/NFC 水平由0.6 增加至0.9 時，瘤胃內氨態氮含量并沒有發生顯著變化，原因可能與發酵底物的能氮比例、瘤胃微生物的組成和活性等因素有關［22］。另外，本試驗中3 個處理組的蛋白質水平之間差異較小也可能是造成瘤胃氨態氮含量比較穩定的原因。與趙娜等［23］的結論一致，氨態氮濃度是日糧中蛋白降解和合成之間的平衡狀況的結果，除了瘤胃內碳水化合物含量的影響之外，氨態氮的含量也主要受到氮利用效率的影響。本試驗中，提高日糧中NDF/NFC 比例顯著增加了瘤胃內總揮發性脂肪酸產量、乙酸相對含量和乙酸/丙酸的比例。Murphy等［24］研究發現將奶牛日糧中粗飼料的比例由30%增加至50%時，其瘤胃內乙酸的相對含量從61.5%增加至64.4%，乙酸/丙酸的比例從3.33 增加至3.63，而丙酸的產量從25.2 下降至22.3 mmol·L?1。同樣的，Kljak 等［21］在后備牛的研究中發現當日糧粗飼料從85%降低至55%時，瘤胃內乙酸含量下降了3.25%，乙酸/丙酸比例下降了6.68%，而丙酸的含量上升了3.37%。以上結果表明，提高日糧中纖維類物質含量能夠使瘤胃發酵類型由丙酸型發酵轉向乙酸型發酵，促進乙酸生成的同時降低丙酸產量，從而影響瘤胃內甲烷的產生［25?26］。

3.4 日糧不同NDF/NFC 水平對后備奶牛瘤胃甲烷排放的影響

反芻動物瘤胃甲烷是飼料有機物在瘤胃內經微生物的降解作用產生的必然副產物。以往的研究發現，除了動物品種及其遺傳特性之外，日糧組成和結構是影響瘤胃甲烷產生的重要因素［27］。本試驗中，日糧的NDF/NFC水平從0.60 增加至0.90 時，甲烷和甲烷能的產量顯著增加，而且甲烷排放強度（甲烷/干物質采食量、甲烷/有機物采食量、甲烷/中性洗滌纖維采食量）也顯著增加。原因可能是，隨著飼料中NDF/NFC 比值的提高，瘤胃發酵產生乙酸和丁酸含量增加的同時氫氣產量不斷增加，這些氫氣作為產甲烷的重要底物，被不斷利用生成甲烷。而飼料中可溶性碳水化合物的含量增加，能夠使瘤胃發酵類型向丙酸型轉變，底物氫氣的產生量減少，從而降低甲烷排放［28］。本試驗中，日糧的NDF/NFC 水平從0.60 增加至0.90 時，乙酸的相對含量增加了6.0%，而丙酸的相對含量下降了28.1%。而乙酸/丙酸的值相應增加了26.6%，從而造成瘤胃甲烷產量增加了13.3%。王增林等［29］的體外試驗結果發現24 h 甲烷產量與乙酸/丙酸呈顯著正相關。有研究認為，單位纖維素發酵產生的甲烷是半纖維素的3 倍，是可溶性殘余物的5 倍，而源于纖維類物質的甲烷排放是可溶性碳水化合物的3 倍以上［30］。與此同時，飼料中非纖維性碳水化合物含量的增加會降低瘤胃內原蟲、纖維素分解菌和產甲烷菌的活性，從而降低甲烷排放［31］。而纖維類物質含量的增加可促進原蟲的豐度，通過產甲烷菌與原蟲之間的氫傳遞作用，有效利用底物氫氣，促進甲烷的排放［32］。此外，甲烷能/總能攝入量作為甲烷轉化因子常用來計算國家或地區內反芻動物的溫室氣體排放清單。由于目前缺乏基本的我國養殖模式特征的甲烷轉化因子，IPCC［33］常采用固定的甲烷轉化因子（6.5%）來計算我國泌乳奶牛和后備奶牛的瘤胃甲烷排放量。本研究發現，隨著日糧中NDF/NFC 比例的增加，后備奶牛的甲烷排放因子為動態的變化值，分別為5.68%，6.65%和7.69%。Niu 等［1］收集了5233 頭奶牛瘤胃甲烷的排放數據，發現泌乳奶牛甲烷轉化因子的范圍為2.7%～9.8%，平均值為6.0%，低于IPCC 的推薦值。同時，Morrison 等［17］采用六氟化硫示蹤技術發現放牧條件下5～10 月齡、12～17 月齡和18～23 月齡的荷斯坦后備奶牛的甲烷轉化因子分別為5.9%、6.9%和6.6%，本試驗結果與此相一致。因此，基于本試驗建立的后備奶牛甲烷轉化因子，可為準確建立我國國家和地區的溫室氣體排放清單提供科學支撐，為實施減排戰略和探索減排措施提供數據支持。

3.5 后備奶牛瘤胃甲烷排放預測模型

盡管多種測定技術和手段能夠對反芻動物瘤胃甲烷的排放量進行準確評估，但由于操作步驟、使用技術等方面的限制，越來越多的研究通過基于動物品種、日糧組成和結構等特征來建立瘤胃甲烷排放預測模型。預測模型能夠提供準確簡便的測定方法，有利于溫室氣體排放清單和開發減排策略的建立和開發。本試驗中，基于干物質采食量建立的預測模型的相關系數為0.74，顯著高于基于體重或中性洗滌纖維含量建立的預測模型。該結果與以往的研究一致，即干物質采食量被認為是預測模型中最為重要的指標，原因是采食量直接決定了瘤胃發酵底物的生成，從而影響甲烷的排放。Jiao 等［11］研究了12 月齡荷斯坦后備奶牛瘤胃甲烷排放和干物質采食量之間的相關關系，且決定系數達到了0.76。Ellis 等［34］綜述了89 頭泌乳奶牛和83 頭肉牛的干物質采食量和甲烷排放數據，發現預測模型的決定系數最大可達到0.685。Hristov 等［35］認為盡管不同瘤胃甲烷測定方法之間存在一定的誤差，但基于干物質采食量建立的預測模型準確度最高（R2=0.63），而與基于中性洗滌纖維采食量的預測模型則準確度較低，決定系數為0.46。前人的研究發現，與單一的預測指標相比，增加預測模型中的變量數量，可顯著提高預測模型的決定系數和預測精度。如，在干物質采食量的基礎上增加中性洗滌纖維采食量顯著提高了本試驗中甲烷預測模型的準確度。Jiao 等［11］研究發現基于干物質采食量和粗飼料比例建立的二元一次預測模型的決定系數能夠超過0.90，而基于代謝能攝入量、中性洗滌纖維采食量和粗飼料比例的三元一次模型的決定系數能夠超過0.95。也有研究發現，與結合甲烷實測值建立的一元一次或多元一次的甲烷預測模型相比，指數方程和Mitscherlich 方程也能夠大幅度提高預測準確度［36］。

4 結論

本研究發現提高日糧中NDF/NFC 水平能夠顯著降低周歲后荷斯坦奶牛的采食量和營養物質表觀消化率，但顯著提高了瘤胃內總揮發性脂肪酸和乙酸含量，提高了瘤胃甲烷排放量和甲烷轉化因子。基于動物的生產性能、日糧的營養物質含量和攝入量建立的預測模型能夠準確反映和評估反芻動物瘤胃的甲烷排放量。