水下爆炸致急性心肺損傷模型中不同劑量烏司他丁的治療效果評價

葉長青，邵先安，王前進，王 靜，馬宏昊，齊曉林，尹 純

0 引 言

爆炸傷是一種戰時發生的特殊類型創傷。現代戰爭中,使用水下爆炸的方式破壞水面艦艇、潛水艇和海軍基地建筑物及水下設施是常見的打擊手段，也對水下作戰或作業人員的健康造成極大威脅[1]。空氣中爆炸引起胸腹部以及脊髓損傷較多，而水下爆炸傷以心肺損傷最常見，也最嚴重，如不及時救治很容易導致損傷對象死亡[2-3]。除了爆炸沖擊波直接作用于胸部的原發性損傷外，大量炎性細胞因子被釋放入血導致的繼發性炎癥損傷也是重要的致死原因[4]。研究發現，腫瘤壞死因子α (TNF-α)是參與心肺損傷炎癥反應的重要炎性細胞因子之一，其與急性心肺損傷發病以及嚴重程度密切相關[5]；中性粒細胞彈性蛋白酶 (NE)是中性粒細胞激活的標志物，也是激活炎癥級聯反應的主要效應因子[6]；白細胞介素8 (IL-8)對多種白細胞具有趨化活性,特別是在炎性反應中可引起局部中性粒細胞的聚集[7]。有研究觀測到兔胸部爆炸傷后IL-6、IL-8及TNF-α顯著升高[8]。基于上述炎性細胞因子在心肺損傷中發揮的重要作用，本研究利用中國科學技術大學爆炸力學實驗室的水下爆炸裝置建立兔急性心肺損傷模型，通過觀察心肺組織的濕干重比值、家兔PaO2及血清中TNF-α、NE和IL-8的水平變化，探討藥物對水下爆炸致急性心肺損傷的治療效果。烏司他丁是一種廣譜胰蛋白酶抑制劑，由人尿液中分離純化而來。它能夠抑制氧自由基的產生、抑制白細胞過度激活，從而保護血管內皮和基膜、降低血管通透性，是一種常用的急性炎癥反應治療藥物[9]。有研究結果提示烏司他丁能抑制TNF-α所引起的血管內皮細胞高通透性，有效抑制急性肺損傷炎癥反應，一定程度上緩解肺水腫與肺出血等癥狀[10]。但目前為止，烏司他丁治療水下爆炸導致急性心肺損傷的效果評價尚缺乏足夠的實驗數據支撐。本研究立足實戰需要，從組織病理到細胞因子在多個層面系統地評價了不同劑量烏司他丁對水下爆炸致急性心肺損傷的治療效果，為開發新型治療策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選取40只健康成年新西蘭雄兔(安徽長臨河醫藥科技有限公司，實驗動物許可證號：syxk(皖)2007-002)，體重為(1.8±0.2)kg。在實驗前適應性喂養3 d，密切觀察一般情況，實驗當天禁食12 h。采用抽簽法將實驗動物隨機分為4組，即正常對照組、爆炸損傷組、低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組，每組10只。利用水下爆炸裝置對爆炸損傷組、低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組造成急性心肺損傷，并在致傷后即刻對低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組分別進行2.5萬U/kg和10萬U/kg的烏司他丁治療

1.2 水下爆炸利用氯胺酮和氟哌利多的混合麻藥麻醉家兔，分別從左頸總動脈和右頸外靜脈放置留置針。手術完成后，將家兔放在鋼制保護箱中，鋼板開窗，窗口的大小和家兔的胸部大小基本吻合。將家兔胸部緊貼窗口，其他部位均保護在鋼板內。隨后將鋼板放置在水下爆炸池內，以1.0 g太安作為爆炸源，家兔距爆心1.8 m，由專業人員實施爆炸。爆炸后立即清理家兔呼吸道，密切觀察其呼吸、心率、精神狀態和應激反應等。

1.3 烏司他丁治療在水下爆炸后即刻對低劑量烏司他丁組和高劑量烏司他丁組進行烏司他丁治療。按照低劑量烏司他丁組(2.5萬U/kg)和高劑量烏司他丁組(10萬U/kg)的標準，根據實驗兔體重計算烏司他丁劑量，用等滲鹽水溶解烏司他丁粉劑(廣東天普生化醫藥有限公司，批號031505264)，然后按照相應的劑量經靜脈置管緩慢推注。

1.4 動脈血氧分壓(PaO2)測量將5 mL注射器用肝素溶液(1000 U/mL)浸潤管壁。在爆炸前以及爆炸后4 h、12 h、24 h分別通過左側頸總動脈抽取2 mL動脈血。原則上借助動脈血壓推動針芯使動脈血自動進入含肝素液的注射器內，然后立即將注射器插入橡膠塞隔絕空氣，隨后利用美艾利爾Epoc? 血氣分析系統測量PaO2。

1.5 心肺組織濕干重比值檢測爆炸24 h后，毀髓法處死家兔，取左肺中葉和心尖部位，等滲鹽水迅速沖洗后迅速吸干表面等滲鹽水和血跡后稱取組織濕重，隨后將組織塊置于80 ℃干燥箱烘干72 h后稱取干重。用濕重除以干重，計算濕/干重比值。

1.6 血清細胞因子濃度測定以3種在炎癥發生發展中發揮重要作用的細胞因子(TNF-α，IL-8，NE)為代表，分析了烏司他丁治療對血清炎性細胞因子水平的影響，進一步探索烏司他丁治療水下爆炸導致急性心肺損傷的效果。在爆炸后4 h、12 h、24 h分別通過左側頸總動脈抽取4 mL動脈血，緩慢注入干管內靜置30 min，在離心半徑25 cm、轉速4000 r/min 條件下離心15 min，收集血清。按照說明書的操作步驟，利用兔TNF-α ELISA試劑盒(上海江萊生物科技公司，批號201602)；兔IL-8 ELISA試劑盒(上海江萊，批號201602)；兔NE ELISA試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，批號20160127FR)完成TNF-α、IL-8和NE濃度測定。

2 結 果

2.1 各組實驗兔生理狀態及PaO2變化爆炸損傷組動物在爆炸后4 h、12 h、24 h出現心跳加速、口唇發紺、呼吸急促、口吐淡紅色黏液等表現，正常對照組中未觀測到上述表現。爆炸損傷組在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2均顯著低于正常對照組(P=0.042，P=0.018，P=0.002)；低劑量和高劑量烏司他丁組在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2與正常對照組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組實驗兔在爆炸后不同時間點的PaO2比較

2.2 各組實驗兔心肺組織的濕干重比值與對照組相比，爆炸損傷組動物的心肌組織和肺組織的濕干重比值均顯著升高(P=0.037，P=0.028)。高劑量烏司他丁組的心肌組織濕干重比值明顯低于爆炸損傷組(P=0.047)，這凸顯了高劑量烏司他丁對水下爆炸致心肌損傷的明確療效。盡管低、高劑量烏司他丁組的肺部濕干重比值與爆炸損傷組比較差異無統計學意義(P=0.649，P=0.267)，但低、高劑量烏司他丁組的肺部濕干重比值中位數低于爆炸損傷組。見圖1。

圖1 各組實驗兔心肌組織和肺組織的濕干重比值比較(紅線代表中位數和四分位間距)

2.3 烏司他丁治療與血清炎性細胞因子水平變化與爆炸損傷組相比，低劑量烏司他丁組的血清TNF-α含量在爆炸后12 h和24 h均明顯降低(P=0.018，P=0.013)，高劑量烏司他丁組的血清TNF-α含量也在爆炸后24 h低于爆炸損傷組(P=0.004)。低、高劑量烏司他丁組血清NE含量均在爆炸后24 h顯著低于爆炸損傷組(P=0.007，P= 0.036)。高劑量烏司他丁組的血清IL-8在爆炸后4 h、12 h、24 h均顯著低于爆炸損傷組(P=0.024，P=0.007，P=0.011)，但低劑量烏司他丁組的血清IL-8與爆炸損傷組之間的差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 爆炸損傷組與烏司他丁組實驗兔的血清TNF-α、NE、IL-8含量比較

3 討 論

建立實驗動物模型是研究水下爆炸傷的基礎，目前主要有兩種方法制作模型：通過激波管產生沖擊波致傷以及直接進行現場水下爆炸[11]。我們采用后一種方法將實驗動物麻醉后固定在水下爆炸裝置內，通過保護裝置可以選擇性地致傷某一部位，如腹部、脊髓等[12]。我們以往的研究僅從細胞因子水平觀察烏司他丁對TNF-α、NF-κB、MMP-9等個別細胞因子的影響，并未從更宏觀的角度全面評價藥物對急性肺損傷的治療效果[13-14]。此外，由于心臟同樣是空腔器官，在實際水下爆炸中心肺損傷往往同時發生，心臟損傷對機體的影響也不容忽視。經過長期對爆炸條件的摸索，我們成功建立水下爆炸急性心肺損傷模型，通過給予不同劑量烏司他丁治療，全面評估兩種劑量烏司他丁對PaO2、炎性細胞因子水平、心肺組織濕干重比值的影響。

急性肺損傷是由肺內中性粒細胞浸潤以及細胞因子及炎癥介質釋放引起的炎癥反應，嚴重的可能發展為急性呼吸窘迫綜合征和頑固性低氧血癥[5]。有研究發現胸部撞擊致家兔急性肺損傷后，家兔PaO2會出現下降[15]。與之相似，本研究觀測到家兔在爆炸損傷后也出現了明顯的PaO2下降。烏司他丁屬于一種廣譜胰蛋白酶抑制劑，能抑制氧自由基的產生、抑制白細胞過度激活，從而保護血管內皮和基膜、降低血管通透性，緩解肺水腫、肺出血等癥狀[9-10]。最新的meta分析提示烏司他丁能夠改善創傷后急性肺損傷患者呼吸功能和預后情況[16]。我們以往探索過血必凈對水下爆震傷的治療效果[17]，但烏司他丁能否有效治療水下爆炸導致的心肺損傷尚缺乏實驗研究。在烏司他丁治療組中，在爆炸后4 h、12 h、24 h的PaO2與正常對照組無統計學差異。不過，與爆炸損傷組相比，低劑量或高劑量烏司他丁治療后血氧分壓并沒有顯著上升，僅呈現出改善的趨勢。這可能是本研究樣本量較少的緣故，要推導出更可靠的結論有待更大規模的研究。濕干重比值是反應炎癥性損傷的一個重要指標，本研究發現無論是心肌組織還是肺組織，在爆炸損傷后的濕干重比值均顯著大于正常對照組，提示空腔器官在沖擊波作用下比較容易出現滲出、水腫等炎性反應。采用烏司他丁治療后，心肌的炎癥反應明顯減輕。肺部的炎性反應呈現減輕的趨勢，但受限于樣本量較少，未觀察到統計學差異。

原發性肺損傷會激活心肺組織內巨噬細胞，后者通過釋放TNF-α 進一步誘導中性粒細胞等釋放IL-6、IL-8 、NE等炎癥因子，趨化中性粒細胞聚集并釋放溶酶體酶、氧自由基，損害血管內皮細胞屏障功能，增加毛細血管通透性,造成繼發性炎癥損傷[18]。在本研究中，烏司他丁治療組實驗兔均在爆炸后觀測到血清TNF-α、NE水平明顯低于爆炸損傷組，這提示高劑量和低劑量烏司他丁治療均對水下爆炸心肺損傷模型的血清TNF-α和NE 水平有抑制效果。高劑量烏司他丁組的血清IL-8在爆炸后4 h、12 h、24 h均顯著低于爆炸損傷組，而該現象并未在低劑量烏司他丁組中觀察到。這表明高劑量烏司他丁對于IL-8的抑制要明顯優于低劑量烏司他丁。

本研究成功建立了可以選擇性致傷胸部的水下爆炸傷動物模型，初步證明了烏司他丁對水下爆炸致急性心肺損傷的治療價值，為未來海上戰傷救治提供治療決策依據。不過本研究樣本量較少，觀察時間較短(致傷后24 h內，屬于早期炎癥反應)，此結論有待于臨床數據進一步驗證。