復方黃連灌腸液總生物堿含量測定研究

倪曉霞，劉曉玲，楊育儒，王慶芬

0 引 言

復方黃連灌腸液是我院消化內(nèi)科協(xié)定處方制成的復方中藥灌腸液，臨床上用于治療潰瘍性結(jié)腸炎，效果顯著。組方由黃連、白頭翁、黃芪、甘草、山藥等13味中藥組成，方中君藥黃連、白頭翁及其他多味中藥均含有生物堿類物質(zhì)。現(xiàn)代藥理學研究表明，生物堿類物質(zhì)具有多種生物活性[1-4]，是重要有效成分，且生物堿含量與其作用功效之間存在正相關(guān)的量效關(guān)系。目前，總生物堿含量測定常用酸性染料比色法[5-6]與紫外分光光度法，但酸性染料比色法，操作繁瑣，干擾因素多，重現(xiàn)性與結(jié)果準確性有待考量[7]。復方黃連灌腸液中總生物堿測定方法未見報道，為加強制劑質(zhì)量控制，確保臨床用藥安全，本文參考有關(guān)文獻[5-11]，建立柱色譜-紫外可見分光光度法測定復方黃連灌腸液中總生物堿含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

紫外可見分光光度計(UV-2550，島津-蘇州)，電子分析天平(AUW120D，島津-日本)，華美冷柜(SY-176，杭州華美電冰箱廠)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ-250DB型，昆山市超聲儀器有限公司)。

鹽酸小糪堿對照品(貴州迪大生物科技有限責任公司，批號：633-65-8)；鹽酸、甲醇、無水乙醇、乙腈、95%乙醇等均購自西隴化工股份有限公司，試劑均為分析純；水為純化水；復方黃連灌腸液(本院自制，批號：20190828、20190829、20190830)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制精密稱取鹽酸小糪堿對照品0.0101 g，置于25 mL量瓶中，加適量鹽酸-甲醇(1∶100)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.404 mg/mL的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，加0.05 mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至刻度，即得80.8 μg/mL的鹽酸小糪堿對照品溶液。

2.2 提取方法考察

2.2.1 直接提取法精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL(批號：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于50 mL量瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液定容，搖勻，靜置1.0 h，過濾，精密量取上述濾液5.0 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得直接提取法供試液，精密量取供試液3.0 mL于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.05 mol/L硫酸溶液為參比，于345 nm測定吸光度，見表1。

2.2.2 超聲提取法精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL(批號：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于100 mL燒杯中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，超聲1 h(超聲功率250 W)，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液定容，精密量取上述濾液5.0 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得超聲提取法供試液，供試液按“2.2.1”項下方法測定吸光度，見表1。

2.2.3 水浴加熱回流提取法精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL(批號：20190828、20190829、20190830)，每批次平行3份，置于250 mL圓底燒瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，水浴加熱回流1 h，冷卻至室溫，過濾，濾液用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，精密量取上述濾液5 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得水浴加熱提取法供試液，供試液按“2.2.1”項下方法測定吸光度，見表1。

表1 復方黃連灌腸液總生物堿提取方法考察結(jié)果

結(jié)果表明，3批復方黃連灌腸液的供試液，超聲提取法與水浴加熱回流提取法的吸光度值明顯高于直接提取法，且與超聲提取法比較，水浴加熱回流提取法供試液的吸光度差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。綜合考慮選擇水浴加熱回流提取法作為供試液總生物堿的提取方法。

2.3 提取方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑考察精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL(批號：20190828)，置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入1%鹽酸溶液、乙腈-1%乙酸溶液(80∶20)、65%乙醇溶液、85%乙醇溶液及鹽酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，編號1至5組，每組平行3份，水浴加熱回流1 h，冷卻至室溫，過濾，濾液用相應溶劑容至50 mL，分別精密量取上述濾液5 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得各組供試液，供試液按“2.2.1”項下方法測定吸光度，平行測定3次，以平均吸光度為縱軸做圖，見圖1a。圖譜提示，第1組、第5組供試液的吸光度大于其他溶劑提取組，且第5組(鹽酸-甲醇(1∶100)溶液)顯著高于第1組。

2.3.2 提取時間考察精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL(批號：20190828)，置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入鹽酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，分別水浴加熱回流0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，每組平行3份，冷卻至室溫，過濾，濾液用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，分別精密量取上述濾液5 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得各組供試液，供試液按“2.2.1”項下方法測定吸光度，平行測定3次，以平均吸光度為縱軸做圖，見圖1b。圖譜提示，提取時間為1.5 h時，供試液吸光度值最大。

1：1%鹽酸溶液；2：乙腈-1%乙酸溶液(80∶20)；3：65%乙醇溶液；4：85%乙醇溶液；5：鹽酸-甲醇(1∶100)溶液

2.4 供試品溶液制備方法結(jié)合上述實驗結(jié)果，綜合考慮實驗過程的高效性與經(jīng)濟效益，最終確定供試品溶液的制備方法：精密稱取復方黃連灌腸液5.0 mL，置于250 mL圓底燒瓶中，加鹽酸-甲醇(1∶100)溶液40 mL，水浴加熱回流1.5 h，冷卻至室溫，過濾，濾液用鹽酸-甲醇(1∶100)溶液定容至50 mL，精密量取上述濾液5 mL，置中性氧化鋁柱上，用0.05 mol/L硫酸溶液洗脫并定容至25 mL，搖勻，即得。

2.5 含量測定方法建立與方法學驗證

2.5.1 最佳吸收波長選擇分別精密量取對照品溶液3.0 mL、供試品溶液5.0 mL(批號：20190828)，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，以0.05 mol/L硫酸溶液為空白，于200～600 nm范圍內(nèi)掃描，見圖2。圖示鹽酸小糪堿對照品溶液在345 nm處有吸收峰；而供試品溶液的吸收峰略微紅移在335 nm處，綜合考慮，最后確定以345 nm為測定波長。

1：供試品溶液；2：鹽酸小糪堿對照品溶液圖2 復方黃連灌腸液紫外吸收光譜圖

2.5.2 線性與回歸方程分別精密量取鹽酸小糪堿對照溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至刻度，制備系列濃度對照品溶液；以0.05 mol/L硫酸溶液為參比溶液，于345 nm處波長處測定吸光度，以濃度(μg/mL)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。計算得回歸方程為：Y=0.17902X+0.0071(r=0.999 98)，表明鹽酸小糪堿對照品濃度在1.616～19.392 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5.3 精密度試驗精密稱取鹽酸小糪堿對照品溶液3.0 mL，置于25 mL量瓶中，平行6份，用0.05 mol/L硫酸溶液定容至刻度，并以0.05 mol/L硫酸溶液為參比，于345 nm處測定吸光度，以吸光度計算相對標準差(RSD)，結(jié)果RSD為0.364%(n=6)，表明精密度良好，見表2。

2.5.4 重復性試驗取同一批復方黃連灌腸液(批號：20190828)，按“2.4”項下方法制備供試品溶液6份，分別精密稱取供試品溶液3.0 mL，置于25 mL量瓶中，用0.05 mol/L硫酸溶液定容，并以0.05 mol/L硫酸溶液為參比，于345 nm處測定吸光度，以吸光度計算RSD%，結(jié)果RSD為0.389%(n=6)，表明供試品重復性良好，見表2。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗精密量取供試品溶液(批號：20190828)3.0 mL，置于25 mL量瓶中，按“2.5.4”項下方法測定，每隔10 min測定1次，以吸光度計算RSD為1.044%(n=6)，供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定，見表2。

表2 復方黃連灌腸液中總生物堿含量測定方法精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗結(jié)果(n=6)

2.5.6 加樣回收率試驗取同一批復方黃連灌腸液(批號：20190828，總生物堿含量為3.554 4 mg/mL)3.0 mL，置于250 mL圓底燒瓶中，分別加入鹽酸小糪堿對照品溶液(0.948 mg/mL)9.0 mL，按“2.4”項下方法制備加樣回收試驗供試品溶液，平行制備6份，分別精密量取上述加樣回收試驗供試品溶液3.0 mL，按“2.5.4”項下方法測定，結(jié)果得平均回收率為100.86%，RSD為1.852%(n=6)，見表3。

表3 總生物堿含量測定方法加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)

2.6 復方黃連灌腸液總生物堿含量測定取復方黃連灌腸液按“2.4”項下方法制備供試品溶液3批(批號：20190828、20190829、20190830)，分別精密量取供試品溶液3.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，0.05 mol/L硫酸溶液稀釋至刻度，搖勻，以0.05 mol/L硫酸溶液為參比，于345 nm測定吸光度，外標法計算總生物堿含量，見表4。

表4 復方黃連灌腸液中總生物堿含量測定結(jié)果(n=3)

3 討 論

生物堿是存在于植物中具有最為顯著活性的效部位成分具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗心血管疾病等作用[16]。目前的文獻報道多是研究植物藥材中總生物堿的提取與質(zhì)量控制[7-9,12-15]，對于富含生物堿的制劑成品研究報道較少[16-17]，本研究建立柱色譜-紫外分光光度法測定復方黃連灌腸液中總生物堿含量的方法，并根據(jù)2015版《中國藥典》對所建立的方法進行方法學驗證，該方法具有簡便快速、準確可靠等優(yōu)點，可以作為復方黃連灌腸液中總生物堿含量測定及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

本研究參考有關(guān)文獻，考察采用總生物堿提取常用的直接靜置、超聲以及水浴回流等方法提取復方黃連灌腸液中總生物堿，結(jié)果表明水浴回流提取法，提取比較完全，紫外吸收度值高于其他兩種方法；再經(jīng)過預實驗確定進一步優(yōu)化考察5種提取溶劑和5個回流時間后，綜合考慮提取效果，最終確定提取方法為以鹽酸-甲醇(1∶100)溶液為溶劑水浴加熱回流1.5 h。

本研究考察最佳吸收波長時，鹽酸小糪堿對照品溶液在228、263、345 nm處有吸收峰，而供試品溶液在279、335 nm處有強吸收，考慮是供試品溶液中其他成分對吸收峰位移的影響，并且在345 nm處供試品的吸收處于肩峰的位置，且波峰基線較平穩(wěn)，峰形較好，最后確定345 nm 為測定波長。