老年重癥肺炎患者血清中活化蛋白C、髓樣分化因子88水平與不良預后的關系

唐先俊 姚欣

重癥肺炎是臨床常見的一種由呼吸道感染引發的嚴重疾病，其發病迅速，可伴有呼吸衰竭、低氧血癥、低血壓等癥狀，在老年人發病中病死率高、預后差，對老年患者生命安全構成極大威脅[1]。活化蛋白C(activated protein C，APC)是胰島素樣絲氨酸蛋白酶家族成員，可調控化學趨化因子、炎性因子及細胞因子的釋放，在多種炎癥疾病中表達失調[2]。曹雪濤等[3]研究顯示外周血APC水平在經烏司他丁治療的重癥肺炎嬰幼兒中明顯升高，可能參與并影響重癥肺炎的發展進程。髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)是Toll/IL-1R家族成員之一，廣泛存在于多種細胞和組織中，表達升高可促進炎性反應[4]。MyD88在重癥肺炎支原體肺炎患兒血清中表達升高，其可能在重癥肺炎支原體肺炎中發揮重要作用[5]。基于此，本研究通過觀察APC、MyD88在老年重癥肺炎患者血清中的水平，并分析兩者與不良預后的關系，以期為動態監控并預后評估老年重癥肺炎提供臨床參考憑據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2017年4月至2018年10月我院收治的老年重癥肺炎患者60例為患病組，其中男32例，女28例；年齡65～80歲，平均年齡(72.47±6.27)歲。選擇同期健康體檢者57例為健康組，其中男29例，女28例；年齡66～79歲，平均年齡(72.28±6.11)歲。2組性別比、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方法符合倫理學規定，經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 標準

1.2.1 重癥肺炎診斷標準：依照《社區獲得性肺炎診斷和治療指南》中的相關判定標準[6]。

1.2.2 納入標準：①符合重癥肺炎診斷標準者；②患者年齡均≥65歲；③生理病理資料完整者；④所有患者或者其家屬簽署知情同意書。

1.2.3 排除標準：①入院時即發生急性心力衰竭、嚴重的肝腎功能不全、慢阻肺者；②合并自身免疫系統疾病、腫瘤者；③合并血小板降低、嚴重凝血功能障礙、活動性出血、顱內出血者；④近期使用糖皮質激素、免疫抑制劑、抗凝藥者。

1.3 評分標準與預后情況 (1)急性生理學和慢性健康狀況Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ，APACHEⅡ)評分標準[7]：常作為判斷重癥加強治療病房(intensive care unit，ICU)患者病情及預后評估的指標，評分范圍0～71分。包含急性生理學評分(APS)、慢性健康評分、年齡評分三部分，最終評分是以上三項評分總和，以APACHEⅡ>15分表示重癥，其分值越高，患者病情越嚴重。(2)預后情況：對60例老年重癥肺炎患者進行28 d隨訪，以患者出院病情轉歸或轉出ICU情況為存活組(39例)、死亡組(21例)。

1.4 主要試劑 TRIzol RNA提取試劑(貨號：5007050)購買于上海酶研生物科技有限公司，cDNA第一鏈合成試劑盒(貨號：WE0132-EOK)購買于北京百奧萊博科技有限公司，SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(貨號：HY-K0501)購買于美國Med Chem Express LLC公司；人APC酶聯免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)試劑盒(貨號：CSB-E09909h-1)購買于上海振譽生物科技有限公司，人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)ELISA試劑盒(貨號：QN-PS0122)購買于上海喬羽生物科技有限公司。

1.5 方法

1.5.1 標本采集及預處理:收集患病組確診當天、健康體檢者當日清晨空腹外周血約4 ml，室溫下靜置約35 min，于4℃以12 000 g離心12 min，收集上層血清，分裝于1.5 ml凍存管中，于-80℃環境中保存，待測。

1.5.2 ELISA法檢測血清APC、TNF-α水平:美國Thermo K3(30000)全自動多功能酶標儀檢測2組受試者血清APC、TNF-α水平，具體檢測步驟參照相關試劑盒說明書。

1.5.3 實時熒光定量法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測2組血清MyD88水平:取出保存于-80℃環境中的血清樣本，冰上解凍，加適量TRIzol裂解樣本，此次加氯仿、異丙醇、70%乙醇提取樣本的總RNA，以0.1% DEPC溶解總RNA，作為逆轉錄的模板。依照qRT-PCR反轉錄試劑盒cDNA第一鏈合成試劑盒操作步驟及注意事項配制逆轉錄反應體系，將樣本總RNA反轉錄成cDNA。qRT-PCR擴增檢測采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，反應體系配制按照其說明書進行。待測MyD88及內參分別設置3個復孔進行半定量檢測。MyD88以β-actin為內參，其對應引物序列見表1，其相對表達量以2-ΔΔCT計算。見表1。

表1 MyD88及內參β-actin引物序列

2 結果

2.1 2組血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ評分情況 與健康組比較，患病組患者血清APC水平明顯降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。患病組患者的APACHEⅡ評分為(22.12±3.77)分。見表2。

表2 2組血清APC、MyD88、TNF-α水平和APACHEⅡ評分比較

2.2 2組不同預后老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平和APACHEⅡ評分比較 與存活組比較，死亡組患者血清APC水平明顯降低(P<0.05)，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組不同預后老年重癥肺炎患者相關指標比較

2.3 老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平與TNF-α、APACHEⅡ評分的關系 Pearson相關性分析結果顯示，老年重癥肺炎患者血清APC與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈負相關(r=-0.412、-0.458，P<0.05)，MyD88與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.356、0.525，P<0.05)。見表4。

表4 老年重癥肺炎患者血清APC、MyD88水平與TNF-α、APACHEⅡ評分的關系

2.4 Logistic回歸分析老年重癥肺炎預后的影響因素 以老年重癥肺炎預后為因變量，以血清TNF-α、APACHEⅡ評分、APC、MyD88為自變量，行Logistic回歸分析，結果顯示TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88為老年重癥肺炎預后的危險因素(P<0.05)，APC為老年重癥肺炎預后的保護因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響老年重癥肺炎預后的Logistic回歸分析

2.5 血清APC、MyD88對老年重癥肺炎患者預后的診斷價值 ROC曲線顯示，血清APC水平預測老年重癥肺炎患者不良預后的曲線下面積(area under curve，AUC)為0.873(95%CI:0.786,0.960)，截斷值為28.65 pmol/L，此時其靈敏度、特異度分別為85.7%、71.8%；血清MyD88水平預測老年重癥肺炎患者不良預后的AUC為0.781(95%CI:0.683,0.910)，截斷值為1.98 pmol/L，此時其靈敏度、特異度分別為71.4%、84.6%；血清APC、MyD88水平預測老年重癥肺炎患者不良預后的AUC為0.918(95%CI:0.840,0.997)，其靈敏度、特異度分別為94.2%、80.5%。見圖1。

圖1 血清APC、MyD88對老年重癥肺炎患者不良預后的ROC評價

3 討論

重癥肺炎多是感染特殊病原微生物引起肺部損傷的危重癥疾病，其發生時伴有大量炎性因子入血、電解質紊亂、腦水腫、膿毒癥等并發癥，病情危重且預后較差，尤其老年人[8]。因此，尋找合理評估重癥肺炎預后指標對患者病情準確評估和改善患者預后具有重要指導意義。

APC是由各種因素刺激蛋白C形成12個氨基酸構成的活性多肽，在胞內信號傳遞、抗凝、抗凋亡、活化內皮細胞屏障等過程中發揮重要調節作用[9]。APC在類風濕性關節炎疾病中表達失調，其可能在類風濕性關節炎炎癥過程中發揮作用[10]。APC在脂多糖誘導的肺損傷中異常表達，其可調節TNF-α、白介素-6等炎性細胞因子，進而影響肺部炎癥程度[11]。以上研究表明APC在炎癥類疾病過程中表達異常。本研究顯示，患病組老年重癥肺炎患者血清APC水平明顯低于健康組，提示APC在老年重癥肺炎疾病進展中起到一定作用。MyD88廣泛分布于肝、脾、腎、肌肉等組織及免疫細胞中，是重要信號傳導分子，可影響機體防御蛋白及細胞因子的轉錄及表達，從而調節免疫炎性反應[12]。MyD88在經通絡開痹片輔助治療的類風濕關節炎患者中表達下調，其可能在炎性反應過程中發揮一定作用[13]。MyD88在Cm呼吸道感染的肺組織中高表達，其可能影響炎性反應進程[14]。本研究中血清MyD88水平明顯高于健康組，提示MyD88可能影響老年重癥肺炎的發生與發展。

TNF-α在重癥肺炎患者血漿中的水平明顯升高，其可作為診治重癥肺炎的輔助指標[15]。APACHEⅡ評分廣泛應用于危重疾病患者的病情嚴重程度及預后情況評估，是老年重癥肺炎的預后影響因素[16]。本研究中老年重癥肺炎患者血清TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯高于健康組，提示老年重癥肺炎與細胞炎性因子、APACHEⅡ評分密切相關。本研究中死亡組老年重癥肺炎患者血清APC水平明顯低于存活組，血清MyD88、TNF-α水平、APACHEⅡ評分明顯明顯高于存活組，提示監測血清APC、MyD88、TNF-α水平及APACHEⅡ評分，對評估老年重癥患者預后有一定的參考價值。

本研究中老年重癥肺炎患者血清APC與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈負相關，MyD88與TNF-α水平、APACHEⅡ評分呈正相關，提示APC、MyD88可能與TNF-α、APACHEⅡ相互影響，從而共同作用于老年重癥肺炎的發病進程。進一步研究發現TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88為老年重癥肺炎預后的危險因素，APC為老年重癥肺炎預后的保護因素，提示升高TNF-α、APACHEⅡ評分、MyD88水平，降低APC水平，均會增加老年重癥肺炎患病幾率，對TNF-α、APC、MyD88水平及時監測，并對患者進行APACHEⅡ評分，有助于及早判定并控制老年重癥肺炎的病情進展。血清APC、MyD88水平對老年重癥肺炎患者預后的預測AUC分別為0.873、0.781，當血清APC含量低于28.65 pmol/L或MyD88表達水平高于1.98，老年重癥肺炎不良預后幾率較高，提示血清APC、MyD88對老年重癥肺炎預后有一定診斷價值，血清APC、MyD88聯合診斷老年重癥肺炎不良預后的AUC為0.918，其靈敏度94.2%，特異度為80.5%，提示APC、MyD88聯合診斷老年重癥肺炎不良預后的價值高于單獨診斷，兩者聯合可提高老年重癥肺炎不良預后的診斷效能。

綜上所述，老年重癥肺炎患者血清APC水平降低，MyD88表達上調，APC和MyD88可能參與老年重癥肺炎的發生發展過程，APC和MyD88聯合可提高老年重癥肺炎預后的診斷價值，具有一定參考價值。