miRNA-133b在卵巢癌組織中的表達及對MMP-9的影響

王愛芹 左衛微 翟文欣

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其死亡率位居婦科惡性腫瘤首位[1]。由于卵巢癌發病隱匿，早期無典型癥狀，超過70%患者初治即為晚期，發生了遠處轉移。初始腫瘤細胞減滅術及術后聯合鉑類藥物為基礎的化療是晚期卵巢癌的主要治療模式，雖然大多數卵巢癌患者對鉑類化療藥物初始反應有較好的應答，但70%患者2年內復發并逐漸發展為鉑類耐藥。近年來發展的分子靶向藥物如貝伐單抗、PARP抑(奧拉帕利、尼拉帕利)等聯合標準化療或傳統的細胞毒化療能夠有效的延長患者的生存，然而目前晚期卵巢癌患者5年生存率仍僅為30%～40%[2]。晚期診斷和鉑類耐藥是導致卵巢癌患者預后不良的主要原因[3]。因此，尋找用于卵巢癌早期診斷及對其侵襲和轉移有預測價值的生物學指標具有重要的臨床意義?；|金屬蛋白酶-9 (MMP-9)屬于鋅肽酶超級家族成員，通過降解細胞外基質及基底膜的Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠，在腫瘤侵襲、轉移過程中發揮重要作用。研究顯示卵巢癌組織中MMP-9表達水平顯著高于正常組織，且其表達水平與卵巢癌分期相關[4,5]。然而其表達異常的調控機制目前尚不明確。微小RNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈RNA，片段長度僅有19～25個核苷酸，在調控基因表達方面起重要作用。miRNA可通過與靶基因信使RNA的3’非編碼區(3’untranslated region，3’UTR)互補性結合來負性調控靶基因表達。生物信息學軟件預測發現miRNA-133b可靶向調控MMP-9基因mRNA的表達。本研究檢測miRNA-133b在卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達情況，并分析其與MMP-9表達的相關性及miRNA-133b的表達水平對卵巢癌的輔助診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年3月至2019年10月于我院婦科住院行手術治療卵巢癌患者52例(病例組)。患者均行腫瘤細胞減滅術，術前均未接受新輔助化療，術后經病理檢查確診為卵巢癌。患者年齡28～73歲，平均年齡(53.8±9.5)歲。腫瘤組織學類型：漿液性腺癌36例、子宮內膜樣癌10例、粘液性腺癌6例；腫瘤分化程度：高中分化28例、低分化24例；FIGO分期：Ⅰ期11例、Ⅱ期7例、Ⅲ期28例、Ⅳ期6例。淋巴結轉移情況：淋巴結轉移陽性16例，淋巴結轉移陰性36例。于同期隨機選取55例因子宮肌瘤或宮頸癌行全子宮雙附件切除患者的正常卵巢組織為對照組，其中子宮肌瘤患者31例，宮頸癌患者24例，術中證實無卵巢腫瘤，術后病理診斷為正常卵巢。對照組患者年齡40～72歲，平均年齡(54.3±7.9)歲；2組年齡差異無統計學意義(P>0.05)。大體標本離體后迅速收集，放于裝有RNAlater液的凍存管里并浸泡，4℃過夜后轉置-20℃低溫保存備用。標本和資料收集均由患者本人知情同意，并獲得醫院倫理委員會批準通過。

1.2 主要試劑與儀器 TRIzol試劑(北京索萊寶生物有限公司)；RNA反轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；Go Taq Green Master Mix(美國Qiagen公司)；miRNA 提取試劑盒(美國Qiagen公司)；miRNA逆轉錄試劑盒(美國Qiagen公司)；miScript SYBR Green PCR Kit(美國Qiagen公司)；PCR引物(上海生工生物工程有限公司)；7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 提取總RNA并將其逆轉錄為cDNA：應用TRIzol試劑按照說明書操作抽提卵巢癌組織及正常卵巢組織總RNA，應用Nanodrop2000檢測總RNA的純度和濃度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。應用RNA反轉錄試劑盒按照說明書操作將提取的總RNA逆轉錄成cDNA，放置于-20℃冰箱保存備用。應用miRNA提取試劑盒抽提上述組織的miRNA，檢測其純度和濃度后，應用miRNA逆轉錄試劑盒按照說明書操作將其逆轉錄成cDNA，-20℃保存備用。

1.3.2 miRNA-133b及MMP-9基因mRNA的檢測:目的基因MMP-9的mRNA檢測應用Go Taq Green Master Mix試劑盒進行PCR擴增，反應體系為：cDNA 模板1.0 μl、上游引物各 1.4 μl、Rox 0.1 μl、Green Master Mix 1.0 μl、最后加去離子水至20 μl；反應條件設定：95℃預變性3 min，然后進行40個循環(95℃變性15 s、58℃退火30 s、72℃延伸25 s)，最后95℃變性15 s、60℃退火60 s、95℃延伸30 s。反應引物序列：目的基因MMP-9上游引物序列5’- GGG ACG CAG ACA TCG TCA TC-3’，下游引物序列5’- TCG TCA TCG TCG AAA TGG GC-3’； 以GAPDH基因為內參，GAPDH基因上游引物序列5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’，下游引物序列5’- TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’。目的基因miRNA-133b應用miScript SYBR Green PCR Kit進行PCR擴增，反應體系為：cDNA 模板1.0 μl、上游引物各 1.0 μl、Ultra SYBR Mix 5.0 μl、最后加去離子水至10 μl；反應條件設定：95℃預變性15 min，然后40個循環(94℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s)。目的基因miRNA-133b上游引物5’- GCG GTT TGG UCC CCT TCA AC -3’，下游引物5’- GTG CAG GGT CCG AGG T-3’；以U6基因內參，U6基因上游引物序列5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物序列5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。根據系統生成的Ct值，采用2-△△CT法進行計算，獲得MMP-9基因mRNA和miRNA-133b在各樣本中的相對表達量。

2 結果

2.1 MMP-9和miRNA-133b在卵巢癌組織和正常卵巢組織中的表達情況 RT-qPCR檢測結果顯示MMP-9基因mRNA在卵巢癌組織中的相對表達量為(1.98±0.64)，在正常卵巢組織中的相對表達量為(1.02±0.41)，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的表達量顯著高于正常卵巢組織，差異有統計學意義(t=9.239，P<0.001)。卵巢癌組織中miRNA-133b的相對表達量為(0.94±0.41)，正常卵巢組織中miRNA-133b的相對表達量為(2.05±0.63)，2組比較，差異有統計學意義(t=-10.648，P<0.001)。見圖1。

圖1 擴增曲線；A：MMP-9基因擴增曲線；B：miRNA-133b基因擴增曲線

2.2 卵巢癌組織中MMP-9和miRNA-133b表達水平的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的表達水平與miRNA-133b表達水平呈顯著負相關關系(r=-0.433，P=0.001)，表明在卵巢癌組織中miRNA-133b可能靶向調控MMP-9的表達。見圖2。

圖2 卵巢癌組織中miRNA-133b與MMP-9 mRNA表達的相關性

2.3 MMP-9基因mRNA表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA的相對表達量與卵巢癌患者的FIGO分期及淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，而與患者年齡、組織學分級、腫瘤病理類型、手術殘余病灶大小無關(P>0.05)。見表1。

表1 MMP-9 基因mRNA表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系

2.4 miRNA-133b表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系 卵巢癌組織中miRNA-133b的相對表達量與卵巢癌患者FIGO分期及淋巴結轉移顯著相關(P<0.05)，而與患者年齡、組織學分級、腫瘤病理類型、手術殘余病灶大小無關(P>0.05)。見表2。

表2 卵巢癌組織中miRNA-133b表達水平與卵巢癌患者臨床病理特征的關系

2.5 卵巢癌組織中miRNA-133b表達對卵巢癌的診斷意義 受試者工作特征曲線分析結果提示miRNA-133b診斷卵巢癌的ROC曲線下面積(AUC值)為0.927，95%可信區間為0.881～0.975，與AUC=0.5比較，差異有統計學意義(P<0.001)，說明卵巢癌組織中miRNA-133b表達對卵巢癌的診斷具有較高的準確性。最優截斷點(cut-off值)為1.638，在最優截斷點靈敏度和特異度分別為76.4%和94.2%；漏診率和誤診率分別為23.6%和5.8%。見圖3。

圖3 卵巢癌組織中miRNA-133b表達水平判斷卵巢癌的ROC曲線

3 討論

卵巢癌是女性生殖道常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌和子宮內膜癌而列居第三位，死亡率卻位居婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌具有極強的侵襲和轉移等生物學行為，這造成其高的致死率。因此，尋找有效抑制腫瘤細胞侵襲和轉移的分子靶點是臨床治療卵巢癌的關鍵所在。本研究分析與腫瘤侵襲相關的MMP-9基因mRNA及可能調控其表達的miRNA-133b在卵巢癌與正常卵巢組織中的表達情況，結果顯示與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中MMP-9基因mRNA表達顯著升高，miRNA-133b表達顯著下調，且兩者的表達量在卵巢癌組織中呈負相關關系；通過ROC曲線分析，卵巢癌組織中miRNA-133b的表達水平對卵巢癌診斷具有較高的準確性。

腫瘤侵襲和轉移是一個主動、復雜、多步驟的過程，包括腫瘤細胞黏附、降解基底膜及細胞外基質，使其突破自身基底膜在間質中形成浸潤灶，再以同樣的方式穿破進入血液或淋巴系統?；|金屬蛋白酶(MMPs)是一類鋅依賴性的內肽酶家族，其在腫瘤侵襲和轉移過程中是必不可少的。MMPs幾乎能降解基底膜所有成分，從而參與腫瘤的侵襲、轉移及血管形成[6]。MMP-9是MMPs家族重要成員之一。MMP-9可降解和破壞基底膜中的主要成分Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，從而促進腫瘤細胞發生侵襲和轉移。Huang等[7]研究發現,將人卵巢癌細胞種植于MMP-9基因缺失型和MMP-9基因野生型裸鼠腹腔內，MMP-9基因缺失組在腫瘤的成瘤率、生長速度、微血管密度等方面顯著低于MMP-9基因野生型組,表明MMP-9在卵巢癌的生長和浸潤過程中發揮重要作用。Sakata等[8]報道了MMP-9在卵巢癌組織中的表達顯著高于正常卵巢組織，且其表達水平隨腫瘤分級的增加而增高。此外，Ozalp等[9]研究表明，表達MMP-9蛋白低的上皮性卵巢癌患者生存時間明顯長于MMP-9表達蛋白高的卵巢癌患者。

本研究結果與上述報道結果一致,卵巢癌組織中 MMP-9基因mRNA表達水平顯著高于正常卵巢組織，提示MMP-9表達升高可能在卵巢組織的癌變過程中發揮作用。淋巴結轉移陽性的卵巢癌患者MMP-9表達水平明顯高于淋巴結轉移陰性患者，說明 MMP-9表達可能與卵巢癌細胞侵襲、轉移的潛能密切相關。臨床分期是判斷卵巢癌患者預后最重要的因素,本研究中Ⅲ、Ⅳ期患者的 MMP-9基因mRNA的表達水平顯著高于Ⅰ、Ⅱ期患者,說明MMP-9表達水平有可能作為判斷卵巢癌患者預后的指標。

miRNA是一類長度約18～25個核苷酸非編碼小分子單鏈RNA，作為重要的基因調控分子，其在調控組織特異性基因表達方面起重要作用。miRNAs以堿基配對的方式與靶基因mRNA的3’UTR結合，誘導沉默復合物形成來抑制靶mRNA的翻譯，從而負性調節靶基因的表達。近年來研究發現，卵巢癌組織中存在多種miRNAs的差異表達，這些表達異常的miRNAs通過調控靶基因的表達在卵巢癌發生、發展過程中起重要作用[10]。先前的文獻報道了miRNA-133b與MMP-9基因存在靶向關系，低表達的miRNA-133b通過上調MMP-9的表達，在腎癌的發生和發展過程中起重要作用[11]。Liu等[12]研究發現下調的miRNA-133b通過靶向調控MMP-9的表達來促進平滑肌細胞的增殖和侵襲能力，從而促進動脈粥樣硬化的形成。生物信息學在線軟件(targetscan和miRanda)分析也證實miRNA-133b與MMP-9基因存在靶向關系，故我們選取miRNA-133b來檢測其在卵巢癌組織中的表達，并分析其在卵巢癌組織中是否與MMP-9基因存在靶向關系。RT-qPCR檢測結果顯示卵巢癌組織中miRNA-133b的表達顯著低于正常卵巢組織，且臨床病理參數分析顯示miRNA-133b的表達水平與卵巢癌患者淋巴結轉移及臨床分期顯著相關。Pearson相關性分析顯示卵巢癌組織中miRNA-133b的表達量與MMP-9基因 mRNA表達水平呈顯著負相關性。這些結果表明表達下調的miRNA-133b可能通過上調MMP-9的表達來增加卵巢癌細胞的侵襲及遷移能力，從而促進卵巢癌的發生和發展。雖然我們的結果及先前的研究報道表明miRNA-133b可能是一種抑癌因子，通過抑制MMP-9的表達來抑制腎癌、大腸癌、卵巢癌細胞的增殖和侵襲能力。但是也有報道稱miRNA-133b可以通過調控SF3B4的表達促進肝癌細胞的增殖和侵襲能力，在肝癌的發生中起促癌作用[13]。因此，需要系統的、深入的研究來明確miRNA-133b在不同腫瘤類型中功能及作用機制。

本研究中，我們采用ROC曲線分析了卵巢癌組織中miRNA-133b表達水平對卵巢癌的診斷價值，結果顯示miRNA-133b對卵巢癌的診斷具有較高的準確性，可以作為卵巢癌的一個診斷預測指標。經過分析最優截斷點(cut-off值)為1.638，其靈敏度和特異度分別為76.4%和94.2%；漏診率和誤診率分別為23.6%和5.8%。在這一cut-off值下所作出的診斷漏診率非常低?？紤]到癌組織的不易獲得性，在后續研究中，我們將進一步研究卵巢癌患者外周血中miRNA-133b的表達情況，明確外周血中miRNA-133b表達水平對于卵巢癌診斷的價值。此外，我們還將應用熒光素酶報告基因載體實驗進一步驗證miRNA-133b與MMP-9的靶向關系。在卵巢癌細胞珠中，通過轉染技術改變miRNA-133b的表達后，觀察卵巢癌細胞珠增殖、侵襲能力的改變情況，從而明確miRNA-133b對卵巢癌細胞生物學功能的影響。

綜上所述，卵巢癌組織中miRNA-133b表達降低可能通過靶向上調MMP-9基因來促進卵巢癌細胞的浸潤和轉移能力，從而在卵巢癌發生、發展中起作用。因此，進一步探索其在卵巢癌發生、發展中的分子機制，可為卵巢癌的早期診斷、預防及治療提供新思路。