miR-509-5p靶向ACLY調(diào)控人黑色素瘤細胞的增殖和凋亡

李二龍 張皓義 韓成龍 謝林伸

人黑色素瘤是一種最常見和最具侵襲性的皮膚腫瘤。近年來，雖然黑色素瘤的綜合治療技術不斷改善，但黑色素瘤的發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢，每年約有7.5萬新增病例，并且黑色素瘤患者預后較差，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者5年生存率低于20%[1,2]。因此，開發(fā)新的黑色素瘤防治策略具有重要意義。miR-509-5p是一種與腫瘤相關的miRNA，研究發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌[3]、乳腺癌[4]和腎癌[5]等多種癌癥中miR-509-5p表達下調(diào)，并發(fā)揮抑癌基因作用。同時，有報道稱miR-509-5p參與調(diào)控黑色素瘤的EMT進程[6]。ATP檸檬酸裂解酶(ACLY)是參與葡萄糖代謝相關的脂質(zhì)生物發(fā)生的重要酶，研究發(fā)現(xiàn)，ACLY在胃癌、膠質(zhì)母細胞瘤、結(jié)腸直腸癌和乳腺癌等腫瘤細胞中表達上調(diào)，miR-133b可通過抑制ACLY表達和活化抑制胃癌細胞的增殖和侵襲[7,8]。生物信息軟件在線預測顯示，ACLY是miR-509-5p的潛在靶基因，但miR-509-5p是否可靶向ACLY調(diào)控人黑色素瘤細胞增殖和凋亡尚未可知。因此，本研究通過體外細胞實驗旨在揭示miR-509-5p靶向調(diào)控ACLY表達對人黑色素瘤細胞增殖和凋亡的影響，以期為miR-509-5p和ACLY作為人黑色素瘤的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人黑色素瘤細胞系A375和SK-MEL-2購于ATCC，正常人表皮黑色素細胞系HEMn-LP、M-254培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、LipofectamineTM 2000和TRIzol試劑均購于Invitrogen公司；RIPA裂解液和 Western相關試劑均購于北京索萊寶公司；PCR引物、miR-509-5p mimics、miR-NC、pcDNA-ACLY、pcDNA、anti-miR-NC、anti-miR-509-5p、ACLY-WT和ACLY-MUT的構(gòu)建和測序由北京華大基因提供；ACLY抗體購于Abnova公司；GAPDH、CyclinD1、CDK2、CDK1、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3抗體購于Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 用M-254培養(yǎng)基培養(yǎng)HEMn-LP細胞，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)SK-MEL-2、UACC903和A375細胞，所有培養(yǎng)瓶中添加10%的胎牛血清，1%的青鏈霉素雙抗，均放置于37℃、含5% CO2、的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，當細胞融合度為80%時進行傳代。取對數(shù)期長勢良好的A375細胞，按照2×105個/孔的細胞密度將其接種于6孔培養(yǎng)板，利用LipofectamineTM 2000分別將miR-509-5p mimics和miR-NC分別轉(zhuǎn)染細胞融合度為60%的A375細胞，轉(zhuǎn)染24～72 h后進行后續(xù)實驗。為進一步證實miR-509-5p是通過調(diào)控ACLY表達進而影響A375的增殖和凋亡，把miR-509-5p mimics和pcDNA-ACLY同時轉(zhuǎn)入A375細胞，檢測過表達ACLY能否逆轉(zhuǎn)miR-509-5p對A375細胞增殖和凋亡的影響。本實驗分組如下：miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-509-5p組(轉(zhuǎn)染miR-509-5p mimics)、miR-509-5p+pcDNA組(轉(zhuǎn)染miR-509-5p mimics和pcDNA空載體)和miR-509-5p+pcDNA-ACLY組(轉(zhuǎn)染miR-509-5p和pcDNA-ACLY)。

1.3 qRT-PCR檢測 采用TRIzol試劑一步法分別提取HEMn-LP、SK-MEL-2、UACC903和各組A375細胞的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進行qPCR擴增。反應體系為20 μl，按照預變性95℃ 15 min，(94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s)40個循環(huán)進行擴增，分析熔解曲線獲得Ct值，用2-ΔΔCt法計算miR-509-5p和ACLY mRNA的相對表達量。引物序列如下：miR-509-5p上游，5’-TACTGCAGACAG

TGGCAAUCA-3’，下游5’GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，U6上游，5’-GCACCTTAGGCTGAACA-3’,下游5’-AG

CTTATGCCGAGCTCTTGT-3’，GAPDH上游，5’-CATGG

CCTTCCGTGTTCCTA-3’，下游5’-TGTCATCATACTTG

GCAGGTTT-3’’，ACLY上游，5’-ATGTCGGCCAAGGC

AAT-TTC-3’，下游5’-CATGCTCATGTGTTCCGGAA-3’。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測 利用生物信息軟件在線預測miR-509-5p的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-509-5p與ACLY的與3’UTR存在連續(xù)結(jié)合位點，猜測ACLY是miR-509-5p的靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因檢測進行驗證。構(gòu)建野生型ACLY-WT和突變型ACLY-MUT的ACLY-3’UTR熒光素酶報告基因載體，利用LipofectamineTM 2000將miR-509-5p mimics和miR-con分別與ACLY-WT和突變型ACLY-MUT共轉(zhuǎn)染A375細胞，將各組細胞置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，檢測各組A375細胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT法檢測細胞活力 將各轉(zhuǎn)染組A375細胞按照2×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，分別于24 h、48 h、72 h時間點向每孔中加入MTT試劑(每孔20 μl)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，再加入DMSO試劑(每孔150 μl)，繼續(xù)孵育2 h，當結(jié)晶物完全溶解后，用全自動酶標儀在490 nm波長處檢測各孔的吸光度值(用空白孔進行調(diào)零)。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 用胰酶(不含EDTA)消化各組A375細胞，離心收集各組細胞，用PBS漂洗2次，加入適量的結(jié)合緩沖液重懸細胞，使細胞濃度約為1×106/ml。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育后，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測 利用RIPA裂解液提取各組A375細胞的細胞總蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg變性蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將已分離的細胞蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶室溫搖床封閉30 min，吸盡封閉液后，用Western Blot洗滌液洗膜3次，每次10 min，分別加入已稀釋的抗ACLY、GAPDH、CyclinD1、CDK2、CDK1、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的Ⅰ抗，室溫孵育2 h后，向已洗滌后的PVDF膜中加入相對應的已稀釋的Ⅱ抗，繼續(xù)室溫孵育1 h，洗膜后，用ECL顯影，拍照后，分析目的條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 人黑色素瘤細胞中miR-509-5p與ACLY的表達 與人表皮黑色素細胞系HEMn-LP比較，人黑色素瘤SK-MEL-2、UACC903和A375細胞中miR-509-5p的表達均顯著下調(diào)，ACLY mRNA的表達均顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1。

表1 人黑色素瘤細胞中miR-509-5p與ACLY的表達

2.2 miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-509-5p組A375細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著降低，細胞增

殖相關蛋白CDK2、CDK1和CyclinD1的表達均顯著降低(P<0.05)，表明過表達miR-509-5p可抑制人黑色素瘤A375細胞的增殖。見表2，圖1。

表2 miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞增殖的影響

圖1 Western blot法檢測細胞增殖相關蛋白表達

2.3 miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞凋亡率的影響 與miR-NC組比較，miR-509-5p組A375細胞的凋亡率顯著升高，促凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞凋亡的影響(A：流式細胞儀檢測細胞凋亡率；B：Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達)

表3 miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞凋亡率的影響

2.4 miR-509-5p負向調(diào)控ACLY的表達 miR-509-5p與ACLY的3’UTR之間存在部分連續(xù)特異性結(jié)合位點。當上調(diào)miR-509-5p表達后，轉(zhuǎn)染ACLY-WT的3’UTR的報告基因的A375細胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染ACLY-MUT的3’UTR的報告基因的A375細胞的熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)。當上調(diào)miR-509-5p表達后，A375細胞ACLY蛋白的表達顯著降低；當下調(diào)miR-509-5p表達后，A375細胞ACLY蛋白的表達顯著升高(P<0.05)。表明，ACLY是miR-509-5p的靶基因，miR-509-5p可負向調(diào)控ACLY的表達。見表4、5，圖3、4。

圖3 ACLY的3’UTR中含有與miR-509-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 ACLY過表達逆轉(zhuǎn)miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞增殖及凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-509-5p組A375細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著降低，細胞凋亡率顯著增加，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，Bax蛋白的表達顯著升高；與miR-509-5p+pcDNA組相比，miR-509-5p+pcDNA-ACLY組A375細胞在24 h、48 h、72 h時的細胞活力顯著升高，細胞凋亡率顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達顯著升高，Bax蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。過表達ACLY可逆轉(zhuǎn)miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。見表6，圖5。

表5 miR-509-5p靶向調(diào)控ACLY表達

圖4 miR-509-5p負向調(diào)控ACLY蛋白的表達

表6 ACLY過表達逆轉(zhuǎn)miR-509-5p過表達對人黑色素瘤A375細胞增殖及凋亡的影響

圖5 Western blot法檢測細胞增殖及凋亡相關蛋白表達

3 討論

腫瘤的發(fā)展是一個復雜的進化過程，受癌基因和抑癌基因的調(diào)控[9]。研究證實，miRNA通過調(diào)控靶基因表達參與細胞的增殖、分換、凋亡和轉(zhuǎn)移等過程，在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。miR-509-5p已被證實在多種惡性腫瘤中表達異常，具有抗腫瘤作用。例如，miR-509-5p在非小細胞肺癌組織中表達下調(diào)，miR-509-5p靶向YWHAG抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲[12]；miR-509在肝癌患者血清中呈低表達，其表達量降低與患者臨床病理特征及不良預后密切相關[13]；miR-509-5p通過靶向MDM2抑制胰腺癌細胞增殖和遷移[14]。然而，miR-509-5p在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用筆者所見鮮有報道。本研究中我們首先對人正常表皮黑色素細胞和3種黑色素瘤細胞中miR-509-5p表達水平進行檢測，結(jié)果顯示，miR-509-5p在3種黑色素瘤細胞中表達下調(diào)。進一步研究證實，過表達miR-509-5p可抑制黑色素瘤A375細胞CDK2、CDK1、CyclinD1和Bcl-2蛋白的表達，促進Bax和cleaved caspase-3蛋白的表達，抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡。這表明miR-509-5p在黑色素瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，與王冬等[6]的研究結(jié)果相吻合。

我們通過靶基因在線預測miR-509-5p的靶基因，結(jié)果顯示，ACLY可能是miR-509-5p下游重要的靶基因。ACLY是一種重要的脂質(zhì)合成酶，在腫瘤中經(jīng)常被過度表達或激活，以促進脂質(zhì)合成和腫瘤的進展[15]。研究發(fā)現(xiàn)，ACLY在骨肉瘤、前列腺癌、宮頸癌和肺癌等惡性腫瘤中表達上調(diào)，miR-22通過靶向下調(diào)ACLY表達抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，促進細胞凋亡[16]。miR-22還可通過靶向下調(diào)ACLY抑制乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移[17]。小干擾RNA或特異性小分子抑制劑如SB-204990靶向ACLY在體內(nèi)外均可抑制腫瘤細胞增殖，提示ACLY是癌癥治療的潛在靶點[17]。本研究還發(fā)現(xiàn)，ACLY在3種黑色素瘤細胞中表達上調(diào)，且ACLY的表達水平與miR-509-5p呈顯著負相關關系。同時雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蛍estern blot檢測顯示，ACLY是miR-509-5p的靶基因，miR-509-5p可負性調(diào)控ACLY的表達。為進一步驗證miR-509-5p是通過下調(diào)ACLY表達進而影響黑色素瘤細胞的增殖和遷移，把miR-509-5p mimics和pcDNA-ACLY共轉(zhuǎn)染A375細胞，發(fā)現(xiàn)過表達ACLY可逆轉(zhuǎn)miR-509-5p對A375細胞的增殖抑制和凋亡促進作用，逆轉(zhuǎn)對CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響。這些研究結(jié)果表明，miR-509-5p通過靶向下調(diào)ACLY表達可遏制黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-509-5p在黑色素瘤細胞中表達下調(diào)，ACLY表達上調(diào)，miR-509-5p通過靶向下調(diào)ACLY表達可抑制黑色素瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。miR-509-5p和ACLY有望成為黑色素瘤的分子治療靶點。