羥考酮對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及PI3K/Akt通路的影響

文放放 李熊剛

肝癌是指來源于肝細胞和肝膽管細胞的惡性腫瘤，分為原發性和繼發性兩類，在我國高發且危害極大的一種臨床常見惡性腫瘤，早期肝癌癥狀常無特異性，中晚期肝癌的癥狀則較多，我國肝癌病死率占全球肝癌病死率的50%，占我國腫瘤致死性疾病第二位[1,2]。肝癌早期缺乏典型癥狀，診斷率低，患者一經確診多已進入終末期，失去手術治療指征，肝癌終末期極易擴散，很難治愈，病死率高[3]。因此尋找具有抗癌活性的藥物成為近來臨床研究熱點。羥考酮(Oxycodone)是從蒂巴因中自然衍生的半合成物，屬于一種強阿片類鎮痛藥物，臨床常用來治療癌癥和慢性非癌癥性疼痛[4]。研究報道，羥考酮預先給藥可通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路、JAK2/STAT3通路等減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞凋亡[5,6]。PI3K/Akt通路是一種重要凋亡抑制通路，通過對靶蛋白磷酸化發揮抗凋亡作用，可促進肝癌細胞生長、增殖、黏附能力及黏附分子表達[7,8]。然而關于羥考酮對肝癌HepG2細胞生物活性的影響筆者所見鮮有研究，因此本研究探討不同濃度羥考酮對肝癌HepG2細胞增殖、凋亡及對PI3K/Akt通路的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑與儀器 HepG2細胞來源于中國醫學科學院，由本科室體外培養凍存備用；鹽酸羥考酮注射液(Oxycodone)均購自美國Gibco；MTT試劑盒(貨號：11465007001)、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號：APOAF)購自美國Sigma。鼠源一抗β-actin抗體(貨號：MA5-15739)、Bcl-2(貨號：13-8800)、Bax(貨號：MA5-13994)、PTEN(貨號：MA5-12278)、AKT(貨號：AHO1112)、兔源cleaved-Caspase3(貨號：700182)、p-AKT(貨號：MA5-14916)抗體、PI3K(貨號：PA5-32550)，p-PI3K(貨號：MA5-14870)二抗羊抗鼠IgG(貨號：A-11001)羊抗兔IgG(貨號：A-11008)均購自美國Invitrogen；CO2培養箱(美國，Thermo Fisher)、熒光顯微鏡(日本，奧林巴斯)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:配制含有10%FBS、1%青鏈霉素RPMI 1640細胞培養液，將肝癌HepG2細胞復蘇后置于37℃ 5%CO2培養箱培養。細胞傳代時用0.25%胰蛋白酶消化。

1.2.2 MTT法檢測肝癌HepG2細胞增殖:將對數期肝癌HepG2細胞接種于96孔細胞板，接種密度約0.5×105個/孔，每孔添加培養液200 L。細胞完全貼壁后更換培養基并添加終濃度為1、10、20、40、80 μg/ml 羥考酮處理(Oxycodone treatment)，對應分別設為OT-1組、OT-10組、OT-20組、OT-40組、OT-80組，另設無任何添加空白肝癌HepG2細胞為對照組(NC組)，每組6個重復，分別培養24、48、72 h。培養結束后用MTT試劑盒檢測各孔細胞增殖情況，具體操作嚴格按照說明書進行。細胞增殖抑制率=(1-ODOT組/ODNC組)×100%。

1.2.3 平板克隆試驗檢測肝癌HepG2細胞克隆能力:取對數期肝癌HepG2細胞，消化、計數后以200個/孔接種于6孔板， 12 h貼壁后更換培養基并添加終濃度為20、40、80 μg/ml羥考酮處理48 h，設為OT-20組、OT-40組、OT-80組，另設NC組，每組6個重復。37℃ 5%CO2培養箱培養2周，出現肉眼可見的克隆集落時停止培養。甲醛固定后，瑞士染色液染色，倒置顯微鏡下觀察，細胞數>50個細胞團作為克隆計數，重復3次取平均值。平板克隆形成率=(平均克隆數/每孔加入單細胞數)×100%。

1.2.4 AnnexinV-FITC/ PI雙染法檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況:取對數期肝癌HepG2細胞約2×105個/孔接種于6孔細胞培養板中，待細胞融合至80%，分組設置同1.2.3。具體操作參照試劑盒說明書，于流式細胞儀檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

1.2.5 WB檢測肝癌HepG2細胞中凋亡相關蛋白及PI3K/Akt通路相關蛋白水平:收集1.2.3中各組肝癌HepG2細胞，嚴格按照蛋白提取試劑盒操作說明提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后，置于-80℃保存備用。具體操作參照文獻[9]，蛋白樣品采用6% SDS-PAGE膠進行電泳，濕轉法將膠上蛋白轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗(Bcl-2抗體 1∶500；Bax抗體 1∶500；PTEN抗體 1∶500；AKT、p-AKT抗體 1∶1 000；PI3K抗體1:50，p-PI3K抗體1∶1 000，cleaved-Caspase3抗體 0.1～0.2 μg/ml；GAPDH抗體 1∶500)4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜3次，20 min/次，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育 1.5 h，洗膜，顯色，曝片，觀察結果并進行分析。

2 結果

2.1 羥考酮對肝癌細胞HepG2增殖的影響 與NC組比較， OT-1組、OT-10組、OT-20組、OT-40組肝癌HepG2細胞增值抑制率呈時間依賴性依次增加，差異有統計學意義(P<0.05)，其中OT-40組、OT-80組肝癌HepG2細胞增值抑制率差異無統計學意義(P>0.05)。OT-40組48 h時，肝癌HepG2細胞抑制率為50.27%，接近半數抑制濃度(IC50)，因此將40 g/ml作為羥考酮最佳濃度，48h作為最佳作用時間用于下游試驗。見表1。

表1 不同濃度羥考酮對肝癌HepG2細胞增值抑制的影響

2.2 羥考酮對肝癌細胞HepG2平板克隆形成率的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組肝癌細胞HepG2平板克隆形成率呈濃度依賴性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 平板克隆形成率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖1。

2.3 羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2 凋亡率增加(P<0.05)，OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 凋亡率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2，表3。

圖2 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響

表3 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2凋亡的影響 n=6

2.4 羥考酮對肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平增加(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平降低(P<0.05)。OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4，圖3。

圖3 WB檢測肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達

表4 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達的影響

2.5 羥考酮對PI3K/Akt通路相關蛋白的影響 與NC組比較， OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平降低(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平升高(P<0.05)。OT-40組與OT-80組肝癌細胞HepG2 中p-PI3K、p-Akt、PTEN蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，PI3K、Akt蛋白在4組中表達水平差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖4，表5。

圖4 WB檢測肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路相關蛋白表達

表5 不同濃度羥考酮對肝癌細胞HepG2中PI3K/Akt通路相關蛋白表達的影響

3 討論

羥考酮是一種半合成的蒂巴因衍生物具有與嗎啡相似的鎮痛效果及不良反應，同屬于強阿片類藥物，但等效果口服羥考酮劑量是嗎啡的1/2，且羥考酮不良反應輕微，生物利用度比較高，給藥途逕較多，因而應用廣泛。羥考酮主要通過激活受體、κ受體發揮鎮痛作用，目前在臨床中主要用于癌痛和急慢性非癌性疼痛的治療,也可用于患者術后鎮痛，可以有效地改善癌痛患者的生活質量，應用前景比較廣闊[10,11]。本研究首先用不同濃度的羥考酮處理肝癌HepG2細胞，發現與NC組比較，羥考酮可能呈濃度依賴的抑制肝癌HepG2細胞增殖，且40 g/ml時的羥考酮作用48 h時，肝癌HepG2細胞抑制率為50.27%，接近半數抑制濃度，因此以40 g/ml羥考酮為最佳處理濃度，48 h為最佳作用時間用于下游試驗。

田蜜等[12]研究發現，羥考酮可通過下調Bcl-2 mRNA，上調Bax mRNA抑制肺腺癌A549細胞增殖，促進其凋亡，減弱其遷移，且效果均比嗎啡好。葉元梅等[5]研究報道，羥考酮預先給藥處理，可以上調大鼠心肌組織Bcl-2蛋白水平，下調Bax蛋白水平，減輕心肌缺血再灌注損傷，抑制心肌細胞的凋亡。Bcl-2定位于線粒體外膜，屬于抗凋亡蛋白，可以促進細胞存活抑制細胞凋亡。Bax同屬于Bcl-2家族，屬于凋亡蛋白，可與Bcl-2形成異二聚體，對Bcl-2產生抑制作用，半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspartate special protein，Caspace)家族包含多種亞基，主要以酶原(uncleaved)形式存廣泛存在于細胞中，其中cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace3、cleaved-Caspace8、cleaved-Caspace9等在細胞凋亡中起決定性作用[13]。本研究結果發現，與NC組比較，羥考酮可呈濃度依賴抑制肝癌HepG2細胞平板克隆形成率、促進其凋亡，上調Bax、cleaved-Caspase3蛋白表達水平，下調Bcl-2蛋白表達水平，且以終濃度40 g/ml時的作用最佳，提示羥考酮可能通過上調Bax、cleaved-Caspase3蛋白、下調Bcl-2蛋白水平，抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡。

PI3K/Akt通路在多種人類腫瘤中表達失調，Akt被PI3K磷酸化激活后可調控細胞周期、促進細胞增殖、抑制細胞凋亡等，PI3K同時具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，可使細胞膜上的肌醇發生磷酸化后變成第二信使，與其下游效應分子Akt結合后使Akt發生磷酸化變成p-Akt，進而可編碼下游凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C和Bcl-2等[14,15]。磷酸酶及張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是一種重要抑癌基因，可負調控PI3K/Akt通路，PTEN在癌細胞中下調表達，其表達與腫瘤進展、淋巴結轉移及預后不良有關[16]。PTEN可通過磷脂酸梅活性降解PI3K活化，是PI3K失去對Akt激活能力，抑制PI3K/Akt通路[17-19]。張萌等[20,21]研究報道，羅格列酮可通過上調PTEN抑制PI3K/Akt通路抑制肝癌HepG2細胞增殖。Chen等[22-25]研究報道，石斛酚可增強caspase-3、PARP和p53蛋白抑制PI3K/Akt通路激活，抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡。本研究結果發現，與NC組比較，OT-20組、OT-40組、OT-80組肝癌細胞HepG2中p-PI3K、p-Akt蛋白表達水平降低(P<0.05)，PTEN蛋白表達水平升高，且40 g/ml羥考酮作用效果最佳，提示羥考酮可能通過上調PTEN，抑制PI3K/Akt通路激活，抑制肝癌細胞HepG2增殖，促進其凋亡。

綜上所述，羥考酮可抑制肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡，可能與通過上調Bax、cleaved-Caspase3、PTEN，下調Bcl-2蛋白，抑制PI3K/Akt通路活化有關系。但羥考酮抑制肝癌HepG2細胞的增殖，促進其凋亡過程中是否還涉及到其他的通路參與，以及PI3K/Ak通路上下游分子表達狀態仍然未知，后期仍需進一步深入探究。