清肺化痰顆粒對慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠的保護作用

王妍 李曉 徐瑩 張俐

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的氣管、支氣管和肺組織炎癥性疾病[1]，為臨床常見多發病，在我國中老年人群中發病率約為8.2%[2]。COPD病程久、預后差、可反復發作，急性加重時會導致患者肺氣管及支氣管炎性反應爆發、氣道粘液高分泌，進而嚴重影響患者肺功能，嚴重時可引起全身各器官損害，并導致死亡[3]。清肺化痰顆粒是由經驗方“清肺化痰湯”依據中醫藥理論而制成的顆粒合劑[4]，研究表明，清肺化痰湯是由桑白皮、黃芩、瓜萎殼等組成的中藥方劑，可祛痰、解熱、平喘，能用于治療COPD[5]；還能有效改善COPD急性加重期患者血液流變性，降低肺部炎性反應、修復肺功能，具有良好的臨床治療效果，且安全性良好[6]，但其作用機制目前還不清楚。NLRP3是組成炎性小體復合物的重要成分，激活炎性小體可使pro-caspase-1裂解為 caspase-1，參與并介導機體多種炎性反應[7]；臭氧誘導的肺部炎癥中NLRP3炎癥小體被激活，下調NLRP3表達可減輕炎癥導致的肺損傷[8]；NLRP3炎性小體還參與COPD患者的機體炎性反應，急性加重期COPD患者外周血單個核細胞中NLRP3、IL-18和 IL-1β表達水平高于穩定期患者及健康人[9]，表明NLRP3炎癥小體信號是治療肺部炎癥的一個分子靶點，可能是清肺化痰顆粒治療COPD急性加重期的作用機制。本文通過使用NLRP3炎性小體抑制劑處理COPD急性加重期大鼠，探討清肺化痰顆粒對COPD急性加重期大鼠的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級SD大鼠60只購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXX(豫)2015-0003，雌雄各半，在清潔、安靜、通風良好的條件下飼養，自然光照，定時更換墊料、清理、消毒鼠籠，自由飲食、飲水、活動，溫度保持在25℃左右，相對濕度保持在約50%，噪音保持在約80分貝，氨濃度<20 mg/L。

1.1.2 主要試劑與儀器:清肺化痰顆粒購自北京長城制藥廠，生產批號：Z11020039，每包9 g；VX-765購自美國Selleck生物科技有限公司，貨號：S2228；GAPDH、NLRP3、caspase-1引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；大前門牌香煙購自上海卷煙廠，焦油含量11 mg/支；大鼠IL-18、IL-1β ELISA試劑盒、兔源GAPDH、NLRP3、caspase-1一抗、羊抗兔二抗購自美國Abcam公司，貨號分別為：ab213909、ab100768、ab181602、ab232401、ab179515、ab150077；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、TBST緩沖液、LPS購自北京索萊寶公司，貨號分別為：P1200、T1081、L8880；RNAiso Plus、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自日本Takara公司，貨號分別為：9108、RR037Q/A/B、639519；RIPA裂解液購自上海碧云天公司、BCA試劑盒、HE染色試劑盒，貨號分別為：P0013K、P0011、C0105等。酶標儀(美國Perkin Elmer公司，型號：Elx800)；蛋白電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad公司，型號分別為：Mini PROTEAN)；全身體積描記法無創非束縛小動物肺功能測量儀(法國EMKA公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf股份公司，型號：Centrifuge 5424R)；輪轉切片機、包埋機、烤片機(德國 Leica 公司，型號分別為：RM2035、EG1160、HI1220)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司，型號：1X70)；電子天平(德國Sartorius 公司，型號：BSA224S-CW)；自制煙熏箱(由熏蒸滅菌箱改造而成，箱體尺寸為60 cm×60 cm×70 cm)等。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立及分組給藥:參照文獻[10]方法制備模型：以0.9%氯化鈉溶液溶解LPS配制為1 g/L 的溶液備用，將SD大鼠放置在自制的煙熏箱中煙熏，每次放入10只大鼠，點燃8支香煙，每天煙熏30 min，持續30 d，并在第1、14、28天做氣管插管并經氣道滴注2 ml LPS溶液，氣道滴注當日不進行煙熏。觀察大鼠生理活動，出現精神不振、食欲減退、反應遲鈍、咳嗽氣喘、毛色灰黃凌亂、呼吸急促、肺部聽診出現雜音等癥狀，取其肺組織進行HE染色，觀察其病理改變，出現肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結構被破壞，融合面積擴大、炎性細胞浸潤等肺損傷癥狀，表示造模成功[11]。共造模48只，分為模型組、清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+ VX-765組4組，每組12只。取12只大鼠氣管插管并經氣道滴注0.9%氯化鈉溶液作為假手術組。清肺化痰顆粒用0.9%氯化鈉溶液稀釋配制成濃度0.1 g/ml溶液待用，清肺化痰顆粒組、清肺化痰顆粒+ VX-765組于每日上午9∶00以10 ml/kg的劑量灌胃[12]；VX-765溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，VX-765組、清肺化痰顆粒+ VX-765組于每日上午9∶00以50 mg/kg劑量腹腔注射[13]，清肺化痰顆粒組于每日上午9∶00同體積腹腔注射DMSO，VX-765組于每日上午9∶00以等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，模型組和假手術組于每日上午9∶00同體積腹腔注射DMSO并以等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，持續7 d。

1.2.2 肺功能指標測定:所有大鼠末次給藥結束24 h后放入體描箱，將生理信號遙測發射盒置于體描箱底部，同時調整監測條件為：氣泵流量2 L/min，傳感器放大倍數500，采樣率200 Hz，輸入校準-50，當有效波形達到90%時記錄不同時間的呼吸參數，采用小動物生理信號遙測分析系統記錄數據并以小動物肺功能軟件分析得出肺功能指標包括呼吸頻率(frequency，f)、潮氣量(tidal volume，VT)、每分通氣量(minute ventilation，MV)、呼氣峰流值(peak expiratory flow，PEF)、吸氣阻力(resistance inspiratory，Ri)。

1.2.3 標本采集及大鼠肺組織損傷情況檢測:所有大鼠末次給藥結束24 h后，以40 mg/kg的劑量腹腔注射4%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，將其以仰臥位固定在操作臺上，解剖并暴露雙肺、氣管、股動脈，剪斷股動脈放血，并在氣管下段剪一小口插入2 ml注射器針頭，以手術線結扎固定、注射器緩慢注入1 ml 0.9%氯化鈉溶液，當大鼠左肺逐漸變得膨隆、蒼白時緩慢回抽灌洗液，然后再將液體緩緩注回肺內，如此反復3次。收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid，BALF)3 ml，轉移至10 ml滅菌離心管中，4 000 r/min、4℃離心5 min，取上清儲存在-80℃冰箱中備用。開胸取出肺組織，剪取約1 g儲存于-80℃中備用；其余肺組織以0.9%氯化鈉溶液漂洗，經固定、梯度乙醇(從低到高)脫水、透明后以石蠟包埋，采用切片機做病理切片，經脫蠟、梯度酒精(從高到低)浸泡后，HE染色試劑盒染色，具體按照說明書進行操作，然后以蒸餾水漂洗、再次脫水、二甲苯透明后封片，在光學顯微鏡下觀察肺組織病理改變情況并拍照，根據損傷嚴重程度做Holfbauer[14]。見表1。

表1 Holfbauer病理評分標準

1.2.4 BALF中IL-18、IL-1β水平測定:取1.2.3中的BALF 4℃下解凍，采用ELISA試劑盒測定BALF中IL-18、IL-1β水平，具體按照說明書進行操作。

1.2.5 肺組織中NLRP3、caspase-1表達水平的檢測

1.2.5.1 qRT-PCR檢測NLRP3、caspase-1 mRNA表達水平，取約0.5 g 1.2.3中的凍存的肺組織剪碎，加入RNAiso Plus并參照其說明書的步驟提取總RNA，采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA后，以熒光定量PCR試劑盒后進行熒光定量PCR反應，反應體系的配制、反應條件的設定按照說明書進行操作，以GADPH為內參基因，qRT-PCR引物序列見表2，2-ΔΔCt算法對數據進行分析。見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.2.5.2 免疫印跡實驗檢測NLRP3、caspase-1蛋白表達水平，取約0.5 g 1.2.3中的凍存的肺組織剪碎，加入預冷的蛋白裂解液(添加蛋白酶抑制劑)混勻，勻漿機制備為勻漿液， 3 000 r/min，4℃離心20 min，取上清液轉移至干凈的Ep管中，即為總蛋白，做好標記，以BCA試劑盒測定5組樣品總蛋白濃度，根據結果5組分別取相同質量的蛋白樣品，以電泳儀進行SDS-PAGE電泳，使用轉膜儀轉移全部分離的蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride，PVDF)上，根據目的蛋白分子量截取蛋白條帶置于小盒中，室溫以5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入相應一抗4℃孵育過夜，TBST溶液漂洗3次，室溫孵育羊抗兔二抗2 h，TBST漂洗3次，以化學發光試劑顯色，Tanon軟件拍攝圖像并分析蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 5組大鼠肺功能比較 與假手術組比較，模型組大鼠VT、Ri顯著升高(P<0.05)，f、MV、PEF顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠VT、Ri均降低(P<0.05)，f、MV、PEF均升高(P<0.05)；與清肺化痰顆粒組及VX-765組分別比較，清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠VT、Ri均降低(P<0.05)，f、MV、PEF均升高(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠肺功能比較

2.2 5組大鼠肺組織損傷情況比較 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結構被破壞，融合面積擴大、炎性細胞浸潤等肺損傷癥狀，Holfbauer評分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠病理損傷癥狀減輕，Holfbauer評分均降低(P<0.05)；與清肺化痰顆粒組及VX-765組分別比較，清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠病理損傷癥狀進一步減輕，Holfbauer評分均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1，表4。

表4 5組大鼠肺組織Holfbauer評分 n=12,分,

2.3 5組大鼠BALF中IL-18、IL-1β比較 與假手術組比較，模型組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05)；與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較，清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠BALF中IL-18、IL-1β水平均降低(P<0.05)。見表5。

表5 5組大鼠BALF中IL-18、IL-1β比較

2.4 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達均降低(P<0.05)；與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較，清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達均降低(P<0.05)。見表6。

表6 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 mRNA相對表達

2.5 5組大鼠NLRP3、caspase-1蛋白表達比較 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對表達顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，清肺化痰顆粒組、VX-765組、清肺化痰顆粒+VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對表達均降低(P<0.05)；與清肺化痰顆粒組和VX-765組比較，清肺化痰顆粒+ VX-765組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對表達均降低(P<0.05)。見圖2，表7。

表7 5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白相對表達比較

圖2 免疫印跡檢測5組大鼠肺組織NLRP3、caspase-1蛋白表達；A 假手術組；B 模型組；C 清肺化痰顆粒(1 g/kg)組；D VX-765(50 mg/kg)組；E 清肺化痰顆粒+VX-765(劑量分別為1 g/kg，50 mg/kg)組

3 討論

近年來COPD的發病率逐年上升，已成為世界范圍內的主要慢性疾病，具有較高的致病率、死亡率，全球每年約600萬人死于COPD，是疾病致死原因的第四位，預計到2020年，將成為全球第三大死亡原因[15]。當其急性發作時，患者肺組織氣管黏膜水腫充血、肺泡結構大量被破壞并融合、炎性細胞浸潤呼吸道，大量分泌粘液，使患者呼吸困難，嚴重威脅患者身心健康、影響生活質量，給患者家庭造成沉重的經濟負擔，治療COPD成為當前的臨床熱點之一，因此本研究具有重要的社會價值及臨床意義[16]。COPD的發病機制目前尚不十分明確，目前公認最主要病因是吸煙，煙草燃燒產生的大量有毒物質能夠促使肺組織中的巨噬細胞、呼吸系統上皮細胞釋放IL-18、IL-1β等炎性因子，使中性粒細胞透過肺泡毛細血管募集至肺部引起炎性反應，導致肺組織發生病理性改變，進而造成大量組織損傷，促進COPD發生發展[17]。本研究采用氣道滴注LPS溶液加煙熏的方法建立慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠模型；由結果可知，相比假手術組，模型組大鼠出現氣管黏膜水腫充血、肺泡結構被破壞，融合面積擴大、炎性細胞浸潤等肺損傷癥狀， Holfbauer評分，肺功能指標VT、Ri顯著升高，肺功能指標f、MV、PEF顯著降低，表明模型大鼠肺部出現炎性反應，肺功能受損，模型制備成功。

研究表明，清肺化痰湯能有效治療急性加重期慢性阻塞性肺疾病，改善患者的臨床癥狀[18]，但其藥理機制目前并不十分清楚，研究發現當NLRP3/caspase-1信號被激活時，可促進免疫細胞合成并分泌大量IL-1β、IL-18，作用于其受體IL-1R 及 IL-18R，觸發NF-κB依賴的一系列信號，引起嚴重的炎性反應[19]， 其還參與調節COPD的發生及疾病的進展，急性加重期COPD患者肺組織中NALP3炎癥小體被激活，NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表達相比穩定期COPD患者顯著升高，穩定期COPD患者NLRP3、caspase-1、IL-18、IL-1β表達相比健康人顯著升高[20]，推測下調NLRP3/caspase-1信號可能是清肺化痰顆粒治療急性加重期慢性阻塞性肺疾病的藥理機制。本研究采用腹腔注射NLRP3炎性小體抑制劑VX-765處理慢性阻塞性肺疾病急性加重期大鼠，結果顯示，經過清肺化痰顆粒及VX-765處理的大鼠病理損傷癥狀均減輕，Holfbauer評分、肺功能指標VT、Ri，BALF中IL-18及IL-1β水平，肺組織中NLRP3及caspase-1表達均降低，肺功能指標f、MV、PEF均升高，表明下調NLRP3/caspase-1信號和清肺化痰顆粒作用類似，均可減輕肺部炎性反應、修復肺損傷，改善肺功能，揭示NLRP3/caspase-1信號是治療急性加重期COPD的靶點，另外VX-765聯合清肺化痰顆粒，大鼠的病理損傷癥狀進一步減輕，Holfbauer評分、肺功能指標VT、Ri，BALF中IL-18及IL-1β水平，肺組織中NLRP3及caspase-1表達均更為降低，肺功能指標f、MV、PEF均進一步升高，表明清肺化痰顆粒和VX-765合用可協同下調NLRP3/caspase-1信號，減輕肺部炎性反應，修復肺損傷，改善肺功能作用更強，揭示NLRP3/caspase-1信號可能是清肺化痰顆粒治療急性加重期COPD的分子機制。

綜上所述，清肺化痰顆粒可減輕肺部炎性反應，修復肺損傷，改善肺功能，下調NLRP3/caspase-1信號可能是其藥理機制，但本文未上調NLRP3/caspase-1信號進行進一步研究驗證，存在一定的不足，還需后續的深入研究。