月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合IGRA對女性生殖器結(jié)核診斷價值

陳紅梅， 王 起， 方 喆， 黃移生， 蔣 源

(湖南省長沙市湖南省胸科醫(yī)院/湖南省結(jié)核病防治所院內(nèi)一科， 湖南 長沙 410006)

女性生殖器結(jié)核(FGT)是因結(jié)核桿菌感染所引起的女性生殖器疾病，該病常見于10～40歲女性，在絕經(jīng)后老年婦女也可見[1]。FGT多因肺結(jié)核、腸結(jié)核等其他臟器結(jié)核血行散播所引起，其中輸卵管結(jié)核占85%～90%，其次為子宮內(nèi)膜結(jié)核、卵巢結(jié)核，該病主要以發(fā)熱、盜汗、乏力、食欲不振、下腹墜痛為表現(xiàn)，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)[2]。FGT與輸卵管性不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等疾病具有較高的相關(guān)性，因此提高該病的診斷效率具有重要的意義[3]。目前對于該病的診斷除全身及婦科檢查外常以子宮內(nèi)膜病理檢查、輸卵管造影、活體組織檢查等方式進(jìn)行，但上述診斷方法均可對患者造成一定的損傷，對于輸卵管和不明原因不孕及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者早期結(jié)核桿菌篩查中適用性不高。月經(jīng)血結(jié)核桿菌熒光定量PCR(FQ-PCR)檢查取材過程無痛方便且被證實(shí)可用于FGT的診斷，但因取材等原因?qū)е略撛\斷方法有一定的漏檢率，因此本研究旨在通過分析月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)對FGT的診斷價值，以期為懷疑生殖器結(jié)核的輸卵管性及不明原因不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者結(jié)核桿菌篩查提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料:選擇2016年7月至2019年9月在湖南省胸科醫(yī)院(湖南省結(jié)核病防治所)就診的輸卵管性及不明原因不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者156例進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行宮、腹腔鏡進(jìn)行常規(guī)病因?qū)W檢查；②在檢查前未接受過抗結(jié)核治療；③患者神志清醒，智力正常，愿意配合相關(guān)檢查；④患者已獲知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并免疫系統(tǒng)疾病者；②既往已確診為FGT的疑似復(fù)發(fā)患者。③其他系統(tǒng)結(jié)核病患者。

1.2方法:對患者進(jìn)行病因?qū)W檢查、月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA檢測。①月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測：在月經(jīng)來潮1～3d，以窺陰器擴(kuò)開陰道后采用無菌注射器吸取月經(jīng)血1～2mL進(jìn)行FQ-PCR檢測，具體操作如下：1mL月經(jīng)血中加入10mL NH4Cl，渦旋混勻后靜置30min，以2500r/min轉(zhuǎn)速離心10min后取沉淀置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ?0μL沉淀加入40μLDNA提取液，吹打混勻后置100℃水浴10min進(jìn)行DNA提取，水浴取出后室溫靜置1h，以13000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液10μL加入反應(yīng)體系，按FQ-PCR試劑盒進(jìn)行常規(guī)操作，≥50Copy則認(rèn)為是陽性。DNA提取試劑盒購于德國默克公司，F(xiàn)Q-PCR試劑盒購于中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，采用美國伯樂公司生產(chǎn)的CFX96型FQ-PCR儀進(jìn)行檢測。②IGRA：抽取患者空腹外周靜脈血4mL肝素抗凝后分離外周血單個核細(xì)胞，在微孔板陰性對照孔中加入50μL的細(xì)胞培養(yǎng)液，陽性對照孔則加入50μL植物血凝素，2個測試孔分別加以50μL的結(jié)核桿菌早期分泌抗原靶6ku蛋白(Early Seeretary Antigenic Target 6ku Protein，ESAT6)抗原(A抗原)及培養(yǎng)濾液蛋白10( Culture Filtrate Protein 10,CFP10)(B抗原)。在上述孔中分別加入稀釋后的外周血單個核細(xì)胞溶液100μL，按英國OxordImmunotec公司生產(chǎn)的試劑盒說明書進(jìn)行孵育、洗滌、顯示等操作。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5且A抗原或B抗原孔斑點(diǎn)數(shù)-孔板對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6；空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)6～10個且A抗原或B抗原孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍孔板對照孔版點(diǎn)數(shù)則認(rèn)為有反應(yīng)性。若與上述情況不符且陽性質(zhì)控對照孔正常則認(rèn)為是無反應(yīng)性。③金標(biāo)準(zhǔn)：常規(guī)術(shù)前檢查無異常者在月經(jīng)干凈后3～7d住院，以腹腔鏡下對患者子宮、卵巢、輸卵管、盆腔情況進(jìn)行檢查，對盆腔腹膜或臟器表面出現(xiàn)粟粒氧結(jié)節(jié)、干酪樣改變、盆腔廣泛黏連鈣化、輸卵管增粗僵硬等疑似病灶進(jìn)行活檢送病理檢查，以鏡下表現(xiàn)及病理結(jié)果結(jié)合可確診為盆腔結(jié)核。內(nèi)膜結(jié)核者宮腔鏡下可見內(nèi)膜不均勻灰白色或干酪狀增生，血管豐富迂曲，嚴(yán)重者可見內(nèi)膜瘢痕化，宮腔黏連，將異常組織送病理檢查，見有典型結(jié)核結(jié)節(jié)即可診斷為內(nèi)膜結(jié)核。根據(jù)金標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果陽性者為病例組，陰性者為對照組。分析月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測聯(lián)合IGRA單獨(dú)檢測與聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核及內(nèi)膜結(jié)核的漏診率。漏診標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查確診者未被檢出即為漏診，聯(lián)合檢測指2種檢測方式均未檢出病理檢查確診者即為漏診。

2 結(jié) 果

2.1一般情況:156例患者輸卵管性及不明原因不孕者共92例，經(jīng)腹腔鏡臨床及病理確診為生殖器結(jié)核21例(病例組)，對照組包括子宮內(nèi)膜異位5例，盆腔黏連49例，正常盆腔17例。復(fù)雜性流產(chǎn)患者64例，宮腔鏡臨床及病理確診為生殖器結(jié)核17例(病例組)，觀察組包括：慢性子宮內(nèi)膜炎36例，正常內(nèi)膜11例。兩組一般情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1 不同組輸卵管性及不明原因不孕者一般情況比較

表2 不同組復(fù)雜性流產(chǎn)患者一般情況比較

2.2不同診斷方法對盆腔結(jié)核漏診率比較:聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為14.29%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨(dú)檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)，見表3。

表3 不同診斷方法對盆腔結(jié)核漏診率比較(n=21)

2.3不同診斷方法對內(nèi)膜結(jié)核漏診率比較:聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為11.76%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨(dú)檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)，見表4。

表4 月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測對FGT診斷效能分析(n=17)

3 討 論

近年隨著耐多藥結(jié)核桿菌及艾滋病的流行、抗生素及免疫抑制劑等藥物的濫用、器官移植增加等原因?qū)е陆Y(jié)核分枝桿菌感染性疾病的發(fā)生率明顯升高的趨勢[4]。結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，若得不到及時、有效的治療可致結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)大量繁殖并破壞入侵白細(xì)胞而引發(fā)結(jié)核病，除毛發(fā)、牙齒及指甲外，機(jī)體所有的組織器官均可受結(jié)核分枝桿菌的感染。臨床上以肺結(jié)核最為常見，肺外結(jié)核多結(jié)核分枝桿菌呼吸系統(tǒng)感染后經(jīng)肺部病變由血液或淋巴系統(tǒng)播散至全省各臟器，調(diào)查數(shù)據(jù)顯示全球每年結(jié)核新發(fā)病例超過800萬，每年有140多萬人因結(jié)核病而死亡，F(xiàn)GT近年來發(fā)病率也有明顯上升的趨勢，約占肺外結(jié)核的11.9%[5]。FGT目前仍是發(fā)展中國家女性不孕及復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的重要病因，結(jié)核桿菌感染生殖器官后可形成慢性炎癥，輸卵管為最早感染部位，其次為內(nèi)膜組織，因感染初期癥狀隱匿，常引起漏診與誤診，但隨著該病的疾病進(jìn)展可經(jīng)腹腔鏡及宮腔鏡發(fā)現(xiàn)不可逆性的病變，對患者的生殖功能造成嚴(yán)重的影響[6]。因此FGT的早診斷、早治療對于保護(hù)患者的生育功能具有重要的意義。

FGT診斷金標(biāo)準(zhǔn)目前仍以病理學(xué)為主，病理學(xué)檢查在獲取組織樣本過程可對患者造成一定損傷，同時在疾病早期患者病變不明顯難以準(zhǔn)確獲得組織樣本，因此目前尚無一種可完全診斷生殖器結(jié)核的方法，多需要結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)并采用多種檢測手段以綜合診斷[7]。因此對于輸卵管性及不明原因不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中可開展生殖器結(jié)核高危患者初步篩查、病原學(xué)檢查及手術(shù)病理學(xué)診斷的階梯式診斷流程。目前臨床上對于病史、基礎(chǔ)體溫、子宮輸卵管造影結(jié)果提示FGT高危的患者進(jìn)行病原學(xué)檢查，但傳統(tǒng)的培養(yǎng)、涂片鏡檢等病原學(xué)檢查方法檢測周期長，技術(shù)條件高，目前應(yīng)用已較少。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)可通過快速擴(kuò)增DNA而實(shí)現(xiàn)多種感染性疾病的快速診斷，尤其是FQ-PCR技術(shù)采用熒光標(biāo)記探針的方法實(shí)現(xiàn)了定量功能且操作過程自動化程度較普通PCR更高，在減少勞動力的同時還可提高檢測的準(zhǔn)確率，同時還可避免操作人員在使用傳統(tǒng)PCR電泳時接觸有毒有害試劑而保護(hù)操作人員的健康。國內(nèi)關(guān)于月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測用于診斷女性生殖器結(jié)核的研究已有相關(guān)報道[8]，該研究認(rèn)為月經(jīng)血為子宮內(nèi)膜周期性脫落及子宮內(nèi)膜層血管所出的血，可有效反映子宮內(nèi)膜、輸卵管等女性生殖器官的生理及病理狀態(tài)，獲取月經(jīng)血這一特殊樣本過程方便無痛，相對于診斷性刮宮、腹腔鏡、宮腔鏡等有創(chuàng)診斷患者接受程度更高。有研究者曾對不孕癥患者取月經(jīng)血、子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行培養(yǎng)、抗酸染色及組織學(xué)檢查，結(jié)果顯示在結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性標(biāo)本中月經(jīng)血占約70%，該研究認(rèn)為月經(jīng)血結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性率高且無創(chuàng)，目前月經(jīng)血培養(yǎng)已成為FGT診斷的金標(biāo)準(zhǔn)之一，但該檢測方法對操作者經(jīng)驗(yàn)要求較高，同時需要至少8周的時間進(jìn)行檢查，不利于患者的早期診斷[9]。使用PCR診斷雖可縮短檢測時間，但漏診率較高，本研究結(jié)果顯示：本研究結(jié)果顯示：月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測對盆腔結(jié)核漏診率為42.86%，內(nèi)膜結(jié)核漏診率35.29%。可能與月經(jīng)血標(biāo)本為血性標(biāo)本，其中的血紅蛋白可抑制Taq酶活性，雖然在前處理過程已進(jìn)行去除血紅蛋白的操作，但仍可引起一定的漏檢。再者月經(jīng)血中結(jié)核桿菌含量較低，月經(jīng)血取樣過程中為整體取樣，無法對疑似病灶進(jìn)行特殊取樣使得其代表性受限，采取多次、多量取樣可能可提高診斷效能[10]。

IGRA主要利用ESAT-6抗原及CFP-10抗原刺激受試者外周血單個核細(xì)胞，再利用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法對IFN-γ分泌細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)而診斷結(jié)核，該方法在2008年被美國FDA批準(zhǔn)用于結(jié)核病的輔助診斷，近年來該方法被用于多種肺外結(jié)核患者的輔助診斷取得滿意的效果[11]，本研究結(jié)果顯示：聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為14.29%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨(dú)檢測的42.86%與IGRA的52.38%(P<0.05)且聯(lián)合檢測對盆腔結(jié)核漏診率為11.76%，低于月經(jīng)血結(jié)核分枝桿菌FQ-PCR檢測單獨(dú)檢測的35.29%與IGRA的52.94%(P<0.05)。IGRA檢測過程中不受卡介苗及其他肺結(jié)核分枝桿菌的影響，另外對于免疫低下或免疫抑制人群的患者結(jié)核桿菌感染T細(xì)胞檢測同樣適用，但該診斷方法無法同時預(yù)測結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展情況，同時該診斷方法無法確定結(jié)核桿菌感染部位，仍需結(jié)合其他相關(guān)檢查[12]。聯(lián)合診斷可彌補(bǔ)不同檢測方法的缺陷而提高臨床的確診率，但因IGRA對實(shí)驗(yàn)室要求較高，檢測費(fèi)用也相應(yīng)升高，聯(lián)合診斷使患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)明顯增加，臨床實(shí)踐過程中可根據(jù)患者意愿先采用月經(jīng)血FQ-PCR檢測，對于檢查陰性但結(jié)合臨床癥狀等其他手段分析疑似的患者可進(jìn)行γ干擾素釋放試驗(yàn)以提高診斷率，發(fā)揮不同診斷的優(yōu)勢而達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)，使患者最大程度獲益[13]。

綜上所述，月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測及IGRA作為輸卵管性及不明原因不孕、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者FGT早期篩查手段均存在一定的漏檢率，兩種診斷方式聯(lián)合檢測可有效降低漏檢率。雖然聯(lián)合診斷的方法可降低漏診率，但需要注意的是若出現(xiàn)月經(jīng)血結(jié)核桿菌FQ-PCR檢測陰性但I(xiàn)GRA陽性時需結(jié)合病理等其他診斷方式才可進(jìn)行最終確診。另外本研究為單中心研究，樣本量較少，指標(biāo)有限，取得的結(jié)果可能出現(xiàn)一定的偏差，下一步將考慮進(jìn)行多中心增加樣本量的研究以進(jìn)一步證實(shí)本研究的觀點(diǎn)。