彌漫大B細胞淋巴瘤患者miR-125表達水平與臨床病理及預后的關系分析

蘭 堅，楊蜀錦，李 妮，王 嬌

彌漫大B細胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma，DLBCL)屬B細胞非霍金奇淋巴瘤(Non-Hodhkin′s Lymphoma，NHL)常見類型，侵襲性強，進展快，其臨床表現、形態學、免疫表型及遺傳特點均存在異質性，療效評估及預后判斷難度大，不利于指導臨床決策[1-2]。目前亟待尋找有效生物標志物指導預后分層。即往多采用國際預后指數(International Prognostic Index，IPI)評估DLBCL患者預后，包含年齡、一般狀態評分、分期、結外受累、血清乳酸脫氫酶等參數，但近期報道顯示，即便存在相同IPI患者仍可能出現不同預后，提示僅依靠臨床特點評估DLBCL患者預后存在局限性[3]。最新研究認為，基因表達譜與DLBCL細胞起源密切相關[4]。微小RNA(Micro-RNA，miRNA)系一類非編碼單鏈小分子RNA，參與靶基因調控，在細胞分化、增殖及凋亡等過程中均發揮重要作用[5]。miR-125位于染色體19q13，近年來發現其在惡性血液疾病中表達異常上調[6]，但與DLBCL患者發病、病理特征及預后的關系尚未完全明確。為探討DLBCL患者miR-125表達特征、病理特征及預后的關系，并為DLBCL防治提供依據，現對收治的148例DLBCL患者的臨床資料進行回顧性分析，報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 回顧性采集2015年3月-2017年3月于四川大學華西醫院血液內科收治的148例DLBCL患者的臨床資料，作為DLBCL組。納入標準：年齡≥18歲；符合中華醫學會血液學分會,中國抗癌協會淋巴瘤專業委員會《中國彌漫大B細胞淋巴瘤診斷與治療指南(2013年版)》中DLBCL診斷標準[7]，經活檢組織病理及免疫組化(包括生發中心來源與非生發中心來源DLBCL；免疫母細胞性、中心母細胞性、變異性形態學)確診，病理見侵襲性大B淋巴細胞腫瘤，彌漫性生長，癌細胞核與正常組織細胞核接近或增大，細胞體積較正常淋巴細胞小(不超過2倍)；腫瘤直徑>0.5 cm；采集標本前未接受放化療或其他治療；初發；臨床及隨訪資料完善。排除標準：血管內及縱膈大B細胞淋巴瘤；累及中樞神經系統者；嚴重心肝腎肺功能不全；合并其他惡性腫瘤；其他惰性淋巴瘤轉化為DLBCL者；合并人類免疫缺陷病毒感染；臨床及隨訪資料不全者。其中男85例，女63例；年齡20～78歲，平均(56.41±10.35)歲；Ann Arbor臨床分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期94例；IPI評分[9]：0～2分94例，3～5分54例。選擇同期收治淋巴結反應性增生(Reactive Hyperplasia of Lymph Node，RH)患者35例作為對照組。其中男20例，女15例；年齡20～76歲，平均(55.97±9.86)歲。

1.2 方法

1.2.1 miR-125表達水平檢測 入院后采集DLBCL及RH病理組織標本，連續10 μm厚度切片，二甲苯固定，14 000 r/min離心120 s后，棄二甲苯，無水乙醇震蕩混合均勻，離心后棄上清，加入無水乙醇，震蕩均勻，離心，室溫晾干，參照RNA抽提試劑盒提取總RNA(試劑盒購自美國Sigma公司)，鑒定純度及濃度滿意后，進行逆轉錄反應(試劑盒購自美國ABI公司)，反應體系：dNTPs 0.15 μL+Reverse Transcroptase 1.0 μL+10×Reverse Transcription Buffer 1.5 μL+RNase Inhibitor 0.19 μL+Nuclese-free water補足至7.0 μL，取逆轉錄產物進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-Time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)(試劑盒購自美國Applied公司)，反應體系：20×TaqMan?Small RNA Assay 1.0 μL+RT reaction 1.33 μL+TaqMan?Universal PCR Master MixⅡ 10.0 μL+Nuclese-free water補足至20.0 μL，上美國ABI公司7500型熒光定量PCR反應儀器進行反應，反應條件：50 ℃、 120 s，95 ℃、 10 min，95 ℃、 15 s，60 ℃、 60 s，共40個循環，以U6為內參，U6引物、miR-125引物設計及合成均由美國Gene Copoeia公司進行，參照2-△△Ct公式計算miR-125相對表達量。

1.2.2 臨床資料收集 調取所有DLBCL患者臨床資料，包括性別、年齡、免疫表型、原發部位、Ann Arbor臨床分期、實驗室指標(血清乳酸脫氫酶水平)、IPI評分、體能狀態評分[10]、B癥狀、結外累及情況、Ki-67指數等，分析miR-125與DLBCL患者臨床病理特點的關系。

1.3 隨訪 所有患者均完成3年隨訪調查，采用電話隨訪、門診復查等方式，自首次明確病理診斷開始隨訪，統計所有患者總生存期(Overall Survival，OS)(自確診至DLBCL所致死亡或隨訪終止時間)。

2 結果

2.1 DLBCL組與對照組患者組織miR-125表達水平比較 DLBCL組患者組織miR-125表達水平明顯高于對照組(t=16.886，P<0.05，圖1)。

圖1 DLBCL組與對照組患者組織miR-125表達水平

2.2 DLBCL組患者組織miR-125表達水平與臨床病理參數的關系 DLBCL組患者組織miR-125表達水平與性別、年齡、原發部位、體能狀況評分、B癥狀無明顯關聯(P>0.05)，免疫表型為非生發中心來源、Ann Arbor臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、乳酸脫氫酶>245 U/L、IPI評分3～5分、結外累及≥2處、Ki-67指數≥75%的DLBCL患者miR-125表達水平更高(P<0.05,表1)。

表1 DLBCL組患者組織miR-125表達水平與臨床病理參數的關系

2.3 DLBCL組患者miR-125表達水平影響因素分析 納入單因素分析中有統計學意義數據進入多因素回歸方程進行賦值，結果顯示，免疫表型、乳酸脫氫酶水平、IPI評分與Ki-67指數均為miR-125表達相關影響因素(P<0.05)，免疫表型為非生發中心來源、乳酸脫氫酶水平越高、IPI評分越高、Ki-67指數越高，組織miR-125表達越高，表2。

表2 DLBCL組患者miR-125表達水平影響因素分析

2.4 DLBCL組患者miR-125表達對預后的影響 按miR-125表達水平高低分為低miR-125表達組(miR-125<4.00，n=78)與高miR-125表達組(miR-125≥4.00，n=70)，低miR-125表達組出現隨訪期間死亡2例，總生存率為97.4%，中位生存時間為36.30個月；高miR-125表達組隨訪期間死亡16例，總生存率為77.1%，中位生存時間為33.67個月，兩組生存情況比較(LogRankχ2=4.488，P=0.034<0.05)，差異有統計學意義(圖2)。

圖2 不同miR-125表達DLBCL患者生存曲線比較

3 討論

DLBCL高度異質性血液系統惡性腫瘤，大多侵襲性較強[11]。以往多通過腫瘤形態學進行分類，但與患者病情進展、預后無明顯關聯[12-13]。目前，多依據腫瘤細胞基因表達譜及免疫組化特征將其分為生發中心來源與非生發中心來源，一般后者預后更差[14]。但最新報道發現，仍有較大一部分生發中心來源DLBCL患者病情緩解后可能復發或對治療無明顯反應性，預后不理想[15]。以往IPI評分常被用于預測DLBCL預后，但劉宜平等[16]發現，相同IPI評分患者仍存在不同預后，該觀點認為，IPI評分尚無法完全反映DLBCL患者異質性特征。

miR-125是近年來發現與血液系統惡性腫瘤發病及進展高度相關的小分子RNA。研究發現，miR-125在多種血液系統腫瘤均可見異常表達，且其作用存在差異[17-18]。Baraniskin等[19]研究顯示，在慢性淋巴細胞白血病及多發性骨髓瘤患者中miR-125存在典型抑癌作用。而在急性髓細胞白血病、急性淋巴細胞白血病中存在典型癌基因作用[20]。但對DLBCL發病過程中miR-125的作用尚未完全明確。張文婷等[21]發現，miR-125在DLBCL復發或進展時表達異常改變，高miR-125表達水平通常提示更短的生存時間。本研究留取DLBCL患者組織標本，并與RH對照，發現DLBCL患者組織miR-125表達較RH明顯上升，支撐闕喜妹等[22]研究結論，提示miR-125在DLBCL發病過程中存在癌基因作用，參與DLBCL發病過程。同時本研究還發現，免疫表型、IPI評分、Ki-67指數均影響DLBCL患者miR-125表達，提示miR-125對區分DLBCL免疫表型，評估預后存在價值。分析原因可能為：miR-125上調可能促進核轉錄因子κ-輕鏈增強，活化下游靶基因，促進DLBCL發生及進展，在DLBCL發病中存在誘導及觸發作用[23]。同時miR-125參與細胞分化、增殖及代謝等構成，調控靶基因轉錄水平，影響腫瘤生物學行為，推測高miR-125表達通過促進DLBCL細胞惡性表型轉化，導致DLBCL進展，并影響其預后。王韋婷等[24]認為血清乳酸脫氫酶影響NHL患者預后，高乳酸脫氫酶患者預后更差。本研究發現在DLBCL患者中存在相似結果，且DLBCL患者乳酸脫氫酶表達對miR-125水平存在影響，推測兩者均參與DCBCL發病過程，對預后有一定影響，但尚需進一步展開分子機制研究證實。而miR-125與DLBCL結外累及范圍、臨床分期等無關，支撐曹迪等[25]結論，考慮臨床分期主要依據病變累及部位及范圍劃分，而miR-125與DLBCL病變受累范圍及部位無明顯關聯。

也有研究發現，miR-125高表達血液系統惡性腫瘤患者OS更短[26]。本研究所有患者均完成3年隨訪調查，隨訪截止日miR-125低表達患者中位OS為36.30個月，而高表達miR-125中位OS為33.67個月，miR-125高表達患者隨訪結束總生存率低于低表達患者，這與Nakayama等[27]統計的5年生存率明顯差異存在相似結論，進一步證實高miR-125表達的DLBCL患者生存預后更差。

綜上，本研究認為，DLBCL患者組織miR-125呈明顯高表達，與患者免疫表型、乳酸脫氫酶水平、IPI評分、Ki-67指數有關，對患者預后存在一定的影響，高表達miR-125提示更短的生存期。推測高表達miR-125可能通過影響免疫表型、乳酸脫氫酶水平及Ki-67指數等參與DLBCL發病及進展過程，但對其確切機制尚待進一步研究論證。