不同性型水果黃瓜內(nèi)過(guò)氧化物酶及同工酶的差異性分析

王鶴冰，向華豐，張洪成，張 生

（重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 401329）

水果黃瓜又稱迷你黃瓜、小黃瓜，是從歐洲引進(jìn)的主要適宜溫室栽培的鮮食類黃瓜品種，在很多地區(qū)作為名特優(yōu)蔬菜被廣泛引種栽培［1］。水果黃瓜作為黃瓜的一個(gè)分支，主要分布在英國(guó)、荷蘭等地［2］。由于引種較晚，中國(guó)目前此類資源缺乏，生產(chǎn)用種多為外國(guó)品種。為提升國(guó)內(nèi)的自主育種能力，近年來(lái)側(cè)重在資源的搜集與創(chuàng)制上下文章。目前，我國(guó)引種的水果黃瓜品種多為雌性系，不能自交繁殖［3］，且制種過(guò)程較繁瑣。為了培育出優(yōu)良的水果黃瓜品種，創(chuàng)制出不同性型的水果黃瓜材料十分必要。

通過(guò)多年的材料引進(jìn)與純化篩選，我國(guó)不同類型的水果黃瓜材料逐漸增加，不同性型的育種材料也逐漸出現(xiàn)，但急需找到一個(gè)簡(jiǎn)單便捷的性型鑒定方法。

黃瓜材料性型的判斷方法很多，最直觀的方法是在生育期進(jìn)行田間自然鑒定，但耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，受環(huán)境影響大。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)逐漸應(yīng)用于作物輔助育種，找到與所需性狀密切相關(guān)的特異性分子標(biāo)記，是在不同環(huán)境影響下，對(duì)作物復(fù)雜性狀進(jìn)行判斷的有效途徑。近年來(lái)分子標(biāo)記在黃瓜雌性系選育中逐步應(yīng)用，如厲建梅等用SSR 分子標(biāo)記進(jìn)行黃瓜雌性性狀的多態(tài)性篩選，得到標(biāo)記位點(diǎn)21個(gè)［4］；苗晗等將F9代RILs 群體用于復(fù)雌花QTL 的定位分析，從中找到8 個(gè)控制復(fù)雌花性狀的QTL 位點(diǎn)［5］。分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展也為后來(lái)雌性基因的定位奠定了基礎(chǔ)。但無(wú)論哪個(gè)方法，對(duì)于常規(guī)的育種者來(lái)講，都存在一定的局限性，因而研究還在進(jìn)一步深入。

1995 年，馬蓉麗在進(jìn)行黃瓜雌性系選育時(shí)，對(duì)黃瓜雌性系和其他品種粗淺地進(jìn)行了種子萌動(dòng)時(shí)期的過(guò)氧化物同工酶分析，發(fā)現(xiàn)雌性系與其他品種比較存在差異［6］，但未做進(jìn)一步研究。之后此方面的研究也并未引起重視，但如果酶的差異可區(qū)分黃瓜材料的性型，將是一個(gè)快速的檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)以此為切入點(diǎn)，以不同性型的水果黃瓜姊妹系為試驗(yàn)材料進(jìn)行研究，尋找不同性型水果黃瓜中過(guò)氧化物酶及同工酶的差異，以其為材料選擇中性型的判斷提供一個(gè)快速的評(píng)判方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以黃瓜課題組自己篩選純化出的2 對(duì)水果黃瓜姊妹系（A1-A2，B1-B2）為試驗(yàn)材料。性型類別見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料性型

試驗(yàn)材料于春季在田間自然條件下播種、育苗，在植株3葉1心期進(jìn)行取樣，取葉片部分用于試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料性型的田間鑒定

為確定材料的性型穩(wěn)定性與一致性，在田間自然條件下進(jìn)行性型鑒定［7］。試驗(yàn)在春秋兩季不同溫度環(huán)境下進(jìn)行，以消除溫度對(duì)黃瓜性型分化的影響。

材料采取常規(guī)穴盤育苗方式，3葉1心時(shí)定植于露地，每份材料隨機(jī)選取10 株，調(diào)查其20 節(jié)內(nèi)的雌花節(jié)位。

1.2.2 過(guò)氧化物酶測(cè)定

過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法［8］進(jìn)行。

樣品制備的步驟：稱取0.2 g葉片組織，加入1 mL提取液，在冰浴上研磨成勻漿。于12 000 r·min-1、4 ℃條件下離心10 min，取上清液，置于冰面上待用。

1.2.3 過(guò)氧化物同工酶電泳分析

過(guò)氧化物同工酶電泳采用垂直板SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）技術(shù)［8］進(jìn)行。

每個(gè)試驗(yàn)材料隨機(jī)取樣兩份作為重復(fù)，進(jìn)行同工酶電泳試驗(yàn)。

樣品制備步驟：稱取試驗(yàn)材料葉片0.5 g加入液氮研磨成粉末狀，加入1.5 mL Tris-Hcl繼續(xù)研磨成勻漿，倒入5 mL離心管中，再分次用2 mL Tris-Hcl將研缽沖洗干凈轉(zhuǎn)入離心管中。在11 000 r·min-1、4 ℃條件下離心20 min，取上清液（酶提取液），將其分裝在2 mL 離心管中與溴酚藍(lán)（1.5 mL 酶提取液+20 μL 溴酚藍(lán)）混合均勻后，置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 雌性系材料的確定

因黃瓜的性型分化受溫度影響較大，因而在試驗(yàn)進(jìn)行前，再次對(duì)所選取的各水果黃瓜試驗(yàn)材料性型進(jìn)行鑒定，確保后續(xù)試驗(yàn)材料性型具有代表性。

從表2 的各材料平均雌花節(jié)位數(shù)統(tǒng)計(jì)可見(jiàn)，雌性系材料的雌花節(jié)位穩(wěn)定，而普通株系在春秋兩季的雌花節(jié)位數(shù)變化較大，在B2材料中秋季雌花節(jié)位數(shù)降低了16%。對(duì)各材料的雌花節(jié)率（見(jiàn)表3）進(jìn)行計(jì)算，可見(jiàn)兩對(duì)材料現(xiàn)狀穩(wěn)定，均為一個(gè)雌性系，一個(gè)普通株，其中A1 為全雌株，雌花率100%，即無(wú)論在任何環(huán)境下均無(wú)雄花出現(xiàn)。

表2 各材料平均雌花節(jié)位統(tǒng)計(jì)

表3 各材料雌花節(jié)率統(tǒng)計(jì)

2.2 過(guò)氧化物酶活性分析

測(cè)定各材料的過(guò)氧化物酶，對(duì)2 對(duì)材料的過(guò)氧化物酶活性進(jìn)行比較分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。兩對(duì)材料中，雌性系材料的過(guò)氧化物酶活性均明顯高于普通株系，B1的酶活比B2高44%，而A1（全雌株類型的雌性系）的酶活更高，較對(duì)應(yīng)的A2普通株系高56%。可見(jiàn)水果黃瓜中雌性比例越高，其過(guò)氧化物酶活性越強(qiáng)。但2對(duì)材料中雌性系與普通株間的過(guò)氧化物酶活性的臨界值還有待進(jìn)一步探索。

圖1 各材料的過(guò)氧化物酶活性

2.3 過(guò)氧化物同工酶譜帶分析

從各材料的同工酶電泳圖（見(jiàn)圖2）中可清楚的看見(jiàn)，在每個(gè)姊妹系中，雌性系材料的同工酶譜帶最后一條與普通株系均有明顯差異。

雌性株系的同工酶譜有明顯的3 條條帶，而普通株系只有2 條明顯的條帶；在普通株系電泳圖中，A2材料的第3 條譜帶顏色很淡，B2 材料的第3 條譜帶甚至完全消失不見(jiàn)。

圖2 各材料的同工酶電泳圖

3 小結(jié)

性型在黃瓜育種中有著重要的地位，特別是當(dāng)黃瓜育種工作由常規(guī)育種逐漸轉(zhuǎn)向雜交育種后，雌性系更是因其簡(jiǎn)便易行的制種技術(shù)被育種者們?cè)谘芯亢屠弥袕V泛青睞［9］。因而找到一個(gè)簡(jiǎn)易的材料鑒別方式對(duì)材料的選擇十分必要。水果黃瓜材料中多數(shù)為雌性系，因而以其為試材，具有代表性。

抗氧化系統(tǒng)是植物抵抗逆境脅迫的重要防御系統(tǒng)，超氧化物歧化酶（SOD）、（過(guò)氧化氫酶）CAT 和過(guò)氧化物酶（POD）是植物清除活性氧的重要抗氧化防御酶［10］。黃瓜的性型分化與溫度關(guān)系密切，如溫度在正常水平上升高，其雌花分化率明顯降低，這可能與抗高溫逆境脅迫有關(guān)，因此該試驗(yàn)就黃瓜雌性與POD間的相關(guān)性展開(kāi)研究。

試驗(yàn)通過(guò)對(duì)水果黃瓜雌性系與其姊妹系的普通株系間的過(guò)氧化物酶活性及同工酶電泳譜帶的比較分析，得到了水果黃瓜普通系與雌性系間過(guò)氧化物酶的明顯差異，雌性系材料的過(guò)氧化物酶活性明顯升高，且同工酶譜帶有明顯的3 條；而普通株系中，過(guò)氧化物酶活性相對(duì)較低，且同工酶譜帶只用2條清晰譜帶，第3條譜帶顏色很淺，甚至消失。