單倍體茄子雄配子發(fā)育過程觀察及育性分析

朱海佳 ，崔群香*，成紅林，趙 妍，何 蕓，邵 英，錢麗君，柏文軍

（1.金陵科技學院，江蘇南京 211169；2.江寧區(qū)農業(yè)農村局，江蘇南京 211169）

茄子（Solanum melongenaL.）是世界范圍內廣泛種植的重要蔬菜作物，在亞洲蔬菜生產中具有十分重要的地位［1］。中國茄子栽培歷史久遠，是茄子次生起源地，茄子類型和品種眾多［2］。茄子果實營養(yǎng)豐富，其中富含的維生素E、維生素P 和龍葵堿等成分可以起到抗氧化等保健作用［3］。

自Guha 和Maheshwari［4］在1964 年通過花藥培養(yǎng)獲得首例單倍體植株以來，運用單倍體技術逐漸成為育種上的熱點［5］。在茄子上，Raina 和Iyer［6］首次通過花藥培養(yǎng)途徑獲得單倍體植株。研究表明單倍體植物常常高度不育，如細胞學鑒定表明甜瓜單倍體植株的雄花和雌花均敗育［7］，西葫蘆單倍體植株也出現花粉敗育的現象［8］。單倍體具有較高的研究價值，但有性繁殖保存困難，需要加倍成二倍體后才能有效保存和研究利用。茄子單倍體植株加倍困難，盡管能夠利用扦插等方式進行繁殖，但繁殖系數很低，且對保存環(huán)境要求高，因此極大地限制了茄子單倍體的研究和利用。

研究發(fā)現，茄子單倍體植株間性狀差異明顯，只有部分單倍體植株能夠結實，且僅極少量植株的果實中有成熟度較高的不育種子。為了探討茄子單倍體植株難以座果和種子敗育的原因，從而有針對性地采取措施，提高花粉和卵細胞活力、種子活力，實現自交繁殖，有必要對單倍體植株的小孢子產生和雄配子體發(fā)育過程進行詳細觀察分析。

目前，關于茄子單倍體植株減數分裂、雄配子體發(fā)育過程及花粉活力的研究未見文獻報道。本研究以花藥培養(yǎng)再生的茄子二倍體植株84-1自交后產生的單倍體植株D5 為試材，采用冷凍切片法和壓片法等對其花粉母細胞減數分裂和雄配子體發(fā)育過程進行觀察，以揭示其花粉和種子活力降低的原因，試圖為單倍體植株的有效利用提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為本實驗室培育保存的單倍體植株D5，該植株春夏季開花但不結實，而可在秋季低溫環(huán)境下座果。為探索總結從D5 植株獲得的減數分裂結束前后的花蕾特征，選擇由花藥培養(yǎng)直接再生出的單倍體植株D4、D8 和D23 的花蕾，用壓片法和染色法進行觀察。

1.2 花蕾形態(tài)觀察

為了探究花蕾形態(tài)與細胞發(fā)育階段間的聯(lián)系，采集D5、D8 和D23 植株上不同大小的花蕾，并將其編號。用游標卡尺測定D5 花蕾總長、萼筒長、花萼基部至抱合的花瓣前端長度、花萼最粗部位的直徑、合生花瓣直徑等，并通過冷凍切片法觀察其細胞發(fā)育時期，根據實驗結果總結D5 植株的花蕾減數分裂前后的形態(tài)特征，并用D4、D8 和D23 植株上的花蕾進行驗證。驗證時選取不同形態(tài)的花蕾，用壓片法（方法見“1.5”）觀察花藥中與生殖相關的細胞發(fā)育時期，然后進行對應分析（方法見“1.5”）。

1.3 細胞發(fā)育時期鑒定

對D5 各個發(fā)育時期的花藥進行冷凍切片法觀測。冷凍切片法采用新鮮的花藥，使用包埋劑將花藥覆蓋并完全冷凍后，置于切片機上切片，將切片轉移到載玻片上，用卡寶品紅染色，隨后用Nikon 80i光學顯微鏡觀察鑒定。

1.4 花粉活力的測定

取D5 植株上盛開花朵的花粉，置于載玻片上，參照申書興［9］的方法，用TTC 染色法測定花粉的活力。其中被染成紫紅色的花粉為有活力的花粉，無法被染色的花粉為無活力的花粉。計數5 個視野里的花粉粒（總數不少于1 000 粒），根據染色結果計算花粉的活力（染色花粉粒數/花粉粒總數×100%）。

1.5 減數分裂鑒定和染色體計數

使用壓片法對D4、D8 和D23 各個發(fā)育時期的花藥進行觀測，并對D5 進行減數分裂鑒定和染色體計數，參照申書興［9］的方法，采用卡諾固定液固定花藥，卡寶品紅染色液染色觀察。

2 結果與分析

2.1 花蕾形態(tài)及細胞發(fā)育階段鑒定

D5花蕾測定結果見表1。觀察發(fā)現，4號和5號花蕾中，花粉母細胞處于減數分裂時期，6 號之后的花蕾，都處于小孢子發(fā)育時期。茄子花粉母細胞減數分裂過程與花蕾大小有密切關系，當花萼基部至合抱的花瓣前端長度比其至花萼筒長度短1～2 mm 時，觀察減數分裂效果較好，此時花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離。當多數花萼裂片開始分離時，則減數分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段。

用D4、D8 和D23 驗證的結果見圖1 和表2。圖1中黑色箭頭所示的D4 花蕾中的母細胞處于減數分裂時期，而其余花蕾均已經進入小孢子及隨后的發(fā)育階段；白色箭頭所示的花蕾盡管與D4 上采摘的最小花蕾大小相似，但其已經完成減數分裂，仔細觀察發(fā)現其花瓣筒已經露出花萼筒，其余所有花瓣筒超出花萼筒的花蕾均已經完成減數分裂。D8 植株上采摘的1號、2號、3號、7號和8號這5個花蕾中花粉母細胞處于減數分裂時期，其余11 個花蕾均完成分裂；D23 植株上的1 號、2 號、4 號和10 號這4 個花蕾處于減數分裂時期，其余6 個花蕾中的花粉母細胞均完成分裂。形態(tài)特征與發(fā)育時期的相關性，D4、D8、D23 植株與D5植株類似：花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離時處于減數分裂時期；當多數花萼裂片開始分離時，則減數分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段。該指標是否適用于二倍體茄子的花蕾有待于驗證。

表1 茄子單倍體植株D5不同發(fā)育時期的花蕾性狀比較

圖1 茄子單倍體植株D4、D8和D23的花蕾形態(tài)

表2 不同單倍體茄子植株花蕾形態(tài)與細胞發(fā)育時期的關系

2.2 單倍體花藥、小孢子和花粉形態(tài)鑒定

對花藥和花粉進一步觀察發(fā)現，單倍體的花藥結構正常（圖2-1），但花粉母細胞由于減數分裂不正常，產生不正常的四分體，甚至“二分體”（圖2-2，2-4，2-5）。小孢子多數不能正常發(fā)育（圖2-3，2-6），僅觀察到單核靠邊期（圖2-7）和少量二核花粉，多數小孢子解體（圖2-3），最終只有少量的花粉發(fā)育成具有3萌發(fā)溝的形態(tài)正常的成熟花粉（圖2-8）。

圖2 單倍體茄子花藥、小孢子和花粉粒形態(tài)鑒定

2.3 單倍體植株的花粉活力鑒定

花粉經TTC 染色后在光學顯微鏡下觀察發(fā)現，花粉粒的大小和形狀有明顯的不同。其中有活力的花粉粒邊緣為紅色，中部為黃褐色，而非活性花粉則全部為黃褐色（見圖3，箭頭示有活力的花粉）。通過計數發(fā)現，有活力的花粉占15%，形狀和大小差異較大，其結出果實數量少，果實褐變速度快，果實無籽，不能產生后代。

2.4 單倍體植株D5減數分裂過程及染色體數目鑒定

由于冷凍切片采取的花蕾僅切到減數分裂前期、四分體和小孢子時期的花藥，因此鑒定染色體數目及對減數分裂整個過程的觀察，主要依據壓片觀察的結果。壓片結果顯示，單倍體植株D5 染色體復制正常，但聯(lián)會開始即出現與二倍體不同的現象，中期Ⅰ單價體在細胞中的排列位置分散（見圖4-4），但能夠清楚地區(qū)分出12 個單價體（見圖5-1，5-2，5-3），因此D5 植株的體細胞染色體數目為12，證明該植株確實為單倍體。

由圖5 可知，單倍體植株D5 減數分裂過程不正常，并不一定產生具有4 個細胞的四分體（圖5-14，示5 核花粉母細胞），可能產生各種類型的“四分體”（圖5-18）。

2.5 D5植株花粉敗育的原因

圖4 單倍體植株D5花粉母細胞減數分裂過程

圖5 D5植株單倍體減數分裂過程發(fā)生敗育

在觀察單倍體植株D5 的減數分裂過程中發(fā)現：中期Ⅰ細胞中有12個單價體，證實該植株確實為單倍體植株；但中期Ⅰ的12個單價體并未排列在赤道面附近，且排列紊亂，染色體聚成2 團或3 團，或各自分散（見圖5-1 至5-7）；根據中期Ⅱ染色體分布情況（見圖5-14，5-15）推測，后期I 以單價體分離為主（見圖5-7 至5-12），存在個別單價體染色單體分離現象（見圖5-13）；單價體分離形式各異，以5/7分離多見，圖5-15表示5/7分離的中期Ⅱ，圖5-16和圖5-17表示后期Ⅱ，顯示后期Ⅱ存在非染色單體分離現象，導致四分體中染色體數目嚴重失衡，產生形態(tài)不正常的四分體（見圖5-18），甚至是二分體。

從減數分裂中期Ⅰ開始，D5植株的減數分裂就出現不正常，未發(fā)現正常的后期Ⅰ細胞，說明植株敗育時期在四分體形成以前，因此敗育比較徹底。推測有活力的花粉主要來源于后期I 按照12/0 或11/1 分離的花粉母細胞。這兩類分離方式占花粉母細胞的比例為2/7，約產生1/7 有活力的花粉，與觀察統(tǒng)計出的花粉活力數值15%較為接近。

3 討論

單倍體是進行體細胞遺傳研究和突變育種的理想材料，花藥和小孢子培養(yǎng)技術則是獲得單倍體的重要途徑［10-11］。油菜小孢子培養(yǎng)獲得的單倍體可應用于雙單倍體育種、誘變育種和轉基因育種等研究［12］。相對于正常植株，單倍體植株僅含有半數的染色體，因此單倍體植株比正常植株在形態(tài)上較為矮小，且生育率低；同時在后代遺傳及生理生化上也表現出一定的差異［13-14］。

張新宇等研究表明山羊豆屬植物減數分裂過程存在一定規(guī)律，與花蕾大小和顏色密切相關［15］。草本植物關蒼術的減數分裂與花蕾大小有密切關系，在花蕾長4～12 mm 時，花粉母細胞進入減數分裂時期［16］。本研究發(fā)現茄子花粉母細胞減數分裂過程也與花蕾大小有密切關系，當花柄基部至合抱的花瓣前端長度比花柄基部至花萼筒長度短1～2 mm 時，觀察減數分裂效果較好，此期花蕾的形態(tài)特征是花萼裂片前端基本抱合，僅個別裂片與其他裂片分離，可以以此作為減數分裂觀測取材的依據，也是進行秋水仙素處理花蕾誘導染色體數目加倍的最佳時期；而當多數花萼裂片開始分離時，則減數分裂結束，進入小孢子發(fā)育階段，對于二倍體或多倍體植株，這是采摘花蕾進行花藥或小孢子培養(yǎng)的最小花蕾指標，但該指標是否適用于所有不同倍性的茄子植株，還需要進一步驗證。研究發(fā)現單倍體茄子植株由于減數分裂不正常，不能形成正常的小孢子，因此不適宜進行花藥培養(yǎng)或小孢子培養(yǎng)。

本研究所用的D5 單倍體植株春季不結實，至秋季11 月開始坐果，其花粉活力極低（15%）。切片觀察顯示單倍體茄子的胞質分裂方式屬于同時型，后期II 以單價體分離為主，也存在染色單體分離現象，這可能是造成該單倍體植株不育的主要原因。分裂末期常形成大小不一的小孢子，且多數小孢子處于單核靠邊期，其后發(fā)育即表現不正常，逐漸解體敗育，證實單倍體高度不育的特點。張彩霞等研究表明減數分裂過程中多分孢子、落后染色體等異常現象會不同程度地促使小孢子中遺傳物質不均衡，從而形成沒有育性的孢子，這是引起花粉育性低的重要原因［17］。本研究所用的D5 植株春季不能結實，是否與花粉活力更低有關，需要測定全生育期花粉活力才能驗證；另外探討環(huán)境等對花粉活力的影響，并采取措施提高花粉活力，使單倍體植株能夠通過有性繁殖加倍為二倍體，是提高茄子單倍體植株保存和利用效率的新思路和新途徑，值得進一步研究。