火力楠種胚組培快繁研究

劉 英

（中國林業科學研究院熱帶林業研究所，廣州 510520）

火力楠（Michelia macclurei Dandy）又名醉香含笑，為木蘭科（Dagnoliaceae）含笑屬（Magnolia）常綠喬木，分布于我國廣東、海南和廣西北部以及越南北部，在我國福建、云南等地亦有引種。其生長速度快，適應性強，已成為我國南方主要造林樹種之一。其樹干通直，木材紋理美觀，有香氣，硬度較高且耐腐，易干燥，少開裂而不反翹，是優良的家具和建筑用材。其樹型美觀、花朵艷麗，是優良的木本花卉、園林樹種；因其燃燒性差，也是我國南方一個主要的防火林帶樹種［1］。

近年來，林業科技工作者從火力楠種質資源收集與評價［2］、苗木培育及栽培技術［3］、木材與林副產加工［4］等方面開展系列研究，拓展了火力楠開發應用前景，造林規模日益增大。目前生產上主要應用種子繁育造林苗，由于種苗差異大，林木分化嚴重，林分生產力難以提高。應用前期優良種質材料開展組培快繁研究，將有利于良種壯苗的規?；a，推動火力楠種植業的快速發展。

木蘭科植物含有較多的酚類物質，容易褐化造成組織壞死而引發組培失?。?］，增大組培難度。褐化現象的產生因物種、品種及個體而異［6］，亦與無機鹽濃度［6～7］、培養基的NH4+、NO3-濃度［8］有關，選擇合適的基本培養基以及探究適宜的抗褐化措施是木蘭科植物組培快繁成功的關鍵所在。對于火力楠而言，僅柳曼瓊等［9］和李雪等［10］開展過增殖和生根培養的初步研究，由于二者增殖苗生長矮小，在生根培養之前均需要經過壯苗環節才能達到生根瓶苗標準，從而導致培養時間長，生產成本升高，污染概率亦增大，不利于組培苗高效生產；二者均以個別材料為對象，其生根培養基及生根效果差異大，說明個體間存在組培難易程度差異。因此，改善火力楠繼代培養基配方，促進增殖培養中芽苗的抽高生長，提高生根芽苗的出苗率，可提升組培苗生產效率；而且研究諸多個體間組培配方差異，對于火力楠組培苗規模化高效生產具有重要的現實意義。

本研究以火力楠2個優良家系10個胚系為試驗材料，從基本培養基、抗褐化、生根誘導等方面開展組培研究，旨在探索出適應大多數胚系生長的組培配方，實現優質苗木的規模化生產，亦為優良火力楠無性系的組培快繁研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

消毒試驗選用家系A 和B 的種子與種胚，其種子采自廣東省云浮市廣東省仙菊林場火力楠采種母樹林?；九囵B基篩選及聚乙烯比洛烷酮（簡稱PVP）抗褐化濃度篩選試驗應用A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、B1 和B2 無性胚系。生根促進劑類型及濃度試驗選擇能抽高生長的A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、B1和B2無性胚系。

1.2 方法

1.2.1外植體消毒及初代培養

采用0.1%的升汞溶液分別對洗凈后種子浸泡處理15、20、30 和40 min，對洗凈后剝殼的胚浸泡處理3、6、9 和12 min，然后用無菌水浸泡清洗，5 min一次，處理4～5次，接種于初代培養基上，每瓶1粒種子，每個處理30瓶，重復3次。

采用MS+0.5 mg·L-16BA+0.2 mg·L-1IBA 為初代培養基，pH6.0～6.2，35 g·L-1蔗糖。在光照強度為2 000～3 500 lx，室溫25±1℃，光照時間8 h·d-1的條件下培養30、60 和90 d 后調查消毒效果，統計染菌數、胚死數、無菌活胚數，匯總統計分析染菌率、胚死率、無菌胚成活率和胚萌發率。

1.2.2增殖培養

基本培養基篩選試驗：剪取1.0 cm 左右的頂芽或側芽，設置MS、3/4MS、2/4MS、1/4MS和LY等5個基本培養基。LY培養基是由MS改良而來，其大量元素含量為：250 mg·L-1NH4NO3、340 mg·L-1KH2PO4、555 mg·L-1MgSO4、1 900 mg·L-1KNO3、332 mg·L-1CaCl2、85 mg·L-1Ca（NO3）2。各培養基均添加0.2 mg·L-16BA、0.2 mg·L-1IBA、35 g·L-1蔗糖，微量元素和有機質含量均為MS。

聚乙烯比洛烷酮（簡稱PVP）抗褐化濃度篩選試驗：采用LY 基本培養基，設置0、2、4、6和8 g·L-15個PVP濃度梯度開展抗褐化試驗。

培養35 d，調查統計以下指標：

同時，調查培養基褐化情況。培養基褐化分級標準為：1 級，培養基無褐化；2 級，25%培養基淺色褐化；3級，50%培養基淺色褐化；4級，75%培養基淺色褐化；5 級，100%培養基淺色褐化；6 級，100%培養基深色褐化。

以上試驗每個胚系均設置5 個處理，每個處理重復15瓶。

1.2.3生根培養

選取苗高≥3.0 cm且具3片以上充分展開葉子的芽苗，應用IBA 及ABT 2 號生根粉兩種生根促進劑設置5 個濃度梯度開展雙因素試驗。兩種生根促進劑的濃度處理均為0（對照）、2.5、5.5、8.5、和11.5 mg·L-1?；诹偟龋?4］和李雪等［15］的生根誘導基本培養基，調整生根基本培養基為0.4MS，添加380 mg·L-1Ca（NO3）2、25 g·L-1蔗糖，微量元素和有機質含量均為MS。每個胚系10 個處理，每個處理重復20 瓶，培養40 d 時調查生根條數和生根率。

1.2.4煉苗與田間移植

生根培養45 d后，在光照強度5 000～10 000 lx的條件下煉苗7～15 d，然后分生根與未生根瓶苗進行移植。移植前用0.5%高錳酸鉀消毒育苗基質（黃心土∶草炭土=7∶3，體積比），移植后一個星期內蓋薄膜，并適當遮蔭，按常規方法進行組培苗管理。對于未生根瓶苗，移植前還需用500 mg·L-1的2 號生根粉浸泡10 min。移植30 和60 d 后分別調查統計生根和未生根瓶苗的移植成活情況。

1.3 數據分析

應用SPSS17.0軟件對試驗數據進行方差分析和多重比較。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒

應用0.1%升汞溶液對火力楠種子消毒15～45 min，均未獲得無菌種子，即使是最長的45 min處理，90 d 后依然從種孔內長出霉菌，污染率達100%。而應用0.1%升汞溶液消毒胚的5 個處理中，除15 min 消毒處理胚全部殺死之外，其余4 個處理（消毒3～12 min）均能獲得無菌胚（見表1）。尤以6 和9 min 處理最好，無菌胚成活率和萌發率顯著高于其他處理（P＜0.05），萌發率高達60%～65%，胚在消毒10～30 d 后萌發。3 min 處理略差，染菌率顯著增高；12 min 處理時間過長，胚死率顯著增高，萌發率顯著降低。

表1 火力楠胚外植體的消毒效果Table 1 DisinfectioneffectforembryoexplantsofM.mac?clurei

2.2 初代培養基對胚培養的影響

各胚系在MS 培養基（MS+6BA 0.5mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1）上進行初代培養（見圖1），第一代（培養45 d）形態生長正常，不同胚對6BA 的敏感程度差異明顯，出現直接誘導叢芽、單芽、未長芽等現象。轉接3 代時，胚生長嚴重分化，出現正常生長、葉片及芽黃化及培養基褐化、頂芽枯死、葉片變形、生根后側芽仍然死亡等情況。由此可見，大多數火力楠胚在MS培養基上生長不良，而且對于部分胚系而言，6BA 濃度（0.5 mg·L-1）偏高，存在玻璃化風險。因此，增殖培養時需要優化基本培養基，降低6BA濃度。

2.3 大量元素對火力楠增殖培養的影響

大量元素含量對各胚系增殖影響顯著（見表2～3），5 個處理間差異達到顯著水平。采用MS 基本培養基（大量元素含量為4 410 mg·L-1），80%的胚系出現嚴重玻璃化及褐化、爛芽、死芽等現象；1/4MS 基本培養基（含量為1 102.5 mg·L-1）處理的增殖芽少，葉片變形，生長緩慢；3/4MS 基本培養基（含量為3 307.5 mg·L-1）可以緩解前二者的部分問題，但不能生產高3 cm 以上的芽苗；采用1/2 MS基本培養基（含量為2 205 mg·L-1），A6、B1、B2 等3個胚系可生產高3 cm 以上的芽苗，但其比例小于10%，其余70%的胚系不能產苗；LY 基本培養基（含量為3 520 mg·L-1）處理的芽苗生長正常，80%胚系（A2 和A4 例外）的平均增殖芽數達到2.5 個以上，90%胚系（A8 未抽高）明顯抽高，3 cm 以上芽苗占比最高達到50.8%，各項指標顯著優于其他4個培養基處理。

各胚系對大量元素含量的需求差異顯著，A6和B1在1/4MS～MS 各種培養基上均能正常生長，其他80%胚系只能在1/4MS～1/2MS 培養基上正常生長良好，但是所有胚系在LY 培養基上生長最好。各胚系的平均芽數、平均芽高、高3 cm以上芽苗平均占比在相同培養基上差異亦達到顯著水平。

大量元素含量對增殖培養基的褐化影響差異顯著（見表4），各胚系在1/4MS～MS 的總鹽份含量中，隨著含量的增大褐化顯著加??；1/4MS 培養基的褐化程度顯著高于LY，1/2MS～MS 培養基的褐化程度則極顯著高于LY（P<0.01）。由此可見，LY 基本培養基抗褐效果最好。對于每個培養基處理，各胚系間褐化程度均差異顯著。

2.4 抗氧化劑對火力楠增殖培養的影響

添加PVP 能夠有效吸附酚類化合物，降低醌的合成，從而減小褐化為害。在0～4 g·L-1濃度范圍內，隨著濃度的增加各胚系褐化為害顯著降低（見表5）；4～8 g·L-1濃度范圍內，隨著濃度的增加褐化為害差異不顯著（P≥0.05）；因此，4 g·L-1為最佳使用濃度。在0～8 g·L-1PVP 濃度范圍內，各胚系間的褐化為害差異顯著，褐化最輕的胚系A6 和B1 與褐化最重的A5、A7 和A8 差異達到顯著水平（P<0.05）。

PVP的添加對增殖芽數的影響不大（見表6）。在0～8 g·L-1濃度范圍內，各胚系平均芽數隨濃度的增加小幅升高，但差異未達顯著水平。胚系間平均芽數差異顯著。B2 平均芽數最多，與A3、A5、A6 大多差異不顯著，而顯著高于其他胚系；A2、A4平均芽數最少，顯著低于其他胚系。

PVP 的添加有利于增殖芽苗的抽高生長（見表6）。在0～8 g·L-1的濃度范圍內，各胚系隨PVP濃度的增加苗高生長增大。A8在6 g·L-1濃度時才顯著抽高生長，且無高3 cm以上的芽苗產出；其他9 個胚系在4 g·L-1濃度時，苗高生長顯著增大，且隨PVP 濃度的增加，高3 cm 以上芽苗占比亦增大，且濃度達4 g·L-1以上時基本穩定。

2.5 生根促進劑對火力楠生根培養的影響

ABT 2 號生根粉生根誘導效果極顯著高于IBA（見表7）。2.5 mg·L-1濃度時，2 號生根粉誘導50%以上胚系生根；8.5 mg·L-1時誘導近70%胚系生根，最高生根率達為93.6%。IBA 在2.5～5.5 mg·L-1濃度范圍內僅誘導10%胚系生根，8.5 mg·L-1時，誘導50%以上胚系生根，生根率均極顯著低于ABT2 號生根粉。9 個胚系間生根誘導差異極顯著。以ABT2 生根粉的處理效果比較，A1、A3 生根率最高，達到80%以上，A5、B1、A6 分別為55.8%、61.5%、35.6%，A4 僅5%，A2、A7、B2 不生根。

A1 胚系在2.5～8.5 mg·L-1濃度范圍內，生根率隨濃度升高而極顯著升高，8.5 mg·L-1時達到最大值；11.5 mg·L-1時，生根率又極顯著降低。生根條數隨濃度的升高而增多，8.5 和11.5 mg·L-1濃度處理顯著高于其他處理。其他胚系得生根率變化規律與A1相似。

表2 大量元素濃度對火力楠繼代苗生長的影響Table 2 Effects of macro-element concentration on growth of subculture plantlets for M.macclurei

表3 大量元素濃度對火力楠增殖苗生長的影響Table 3 Effects of macro-element concentration on growth of proliferating plantlets for M.macclurei

表4 大量元素濃度對培養基褐化的影響Table 4 Effect of macro-element concentration on medium browning

表5 PVP濃度對培養基褐化的影響Table 5 Effect of PVP concentration on medium browning

表6 PVP濃度對增殖苗抽高生長的影響Table 6 Effect of PVP concentration on height growth of plantlets

2.6 瓶苗移植效果

煉苗后，將瓶苗分類移植。30 d 后生根芽苗移植成活率高達90%以上，60 d 后未生根芽苗移植成活率達80%以上。

3 討論

利用種胚開展組培研究，能否獲得無菌外植體，主要與種子結構特點、消毒方法有關。對于種孔緊密、外菌不易侵入的種子而言，確定好藥劑和消毒時間即可直接消毒種子獲得無菌外植體［11～12］；帶胚蓋的棕櫚科種子，種子消毒后還需要去除胚蓋［13］；火力楠種孔不緊密、無胚蓋，胚表面存有雜菌，消毒難度大，只有去除種殼取出胚進行消毒才能成功。應用0.1%升汞溶液消毒胚6～9 min，能獲得60%～65%無菌且可萌發的外植體。

基本培養基是影響組培苗正常增殖的重要因素，也是引起褐化發生的主要因素之一［14］。大量研究表明，低濃度無機鹽有利于降低褐化［6～7］，降低NH4+、提高NO3-濃度能減輕組織褐化［8］。有人采用1/2MS［9］和1/3MS［10］大量元素開展火力楠增殖培養，盡管繁殖系數高，但其芽苗矮小，需經30～35 d 壯苗培養方可進行生根培養。本研究發現，2個胚系在1/4～1MS 各種培養基上均能正常生長；其他8 個胚系在1/4～1/2MS 上才能正常生長，若大量元素濃度再增加，則導致增殖苗玻璃化及褐化加劇，與以往研究結果基本一致。所有胚系均在LY 培養基上增殖效果最佳，究其原因，與大量元素配比有關。LY 培養基調整了NH4NO3、KH2PO4和MgSO4的含量，并添加Ca（NO3）2，各元素配比發生變化，其鹽分含量為3 520 mg·L-1，比MS含量低，比其他1/4～3/4MS含量高，增殖芽苗生長正常，極顯著降低褐化程度、提高增殖倍數和生根有效苗率。由此可見，調整大量元素配比相較鹽分濃度，對火力楠組培增殖效果影響更大。采用LY 培養基，僅A8 胚系難抽高，其余9 個胚系抽高生長明顯，6 個胚系3 cm 以上高度芽苗占比在30%以上，2個胚系在50%。在最優培養基LY 上，各胚系間褐化差異并沒有1/4MS～MS系列培養基明顯，說明LY培養基具有其普適性。

酚類物質經氧化形成醌類化合物，在氨酸酶的作用下，與繁殖材料的蛋白質聚合，造成其他酶系統的失活而致代謝混亂，影響植物生長。因此，對于酚類物質含量高的木蘭科植物而言，解決褐化毒害問題是實現其組培成功的關鍵環節。選擇適宜外植體［6］、基本培養基［6～7］、生根促進劑類型及濃度［15～16］、添加抗氧化劑［15～18］是抗褐化的主要方法。PVP 是一種酚類物質吸附劑，通過吸附酚類物質阻止醌類物質形成，達到抗褐化之目的［19］。如，天女木蘭在PVP 1 g·L-1濃度時，能有效降低褐化傷害［17］；景寧木蘭在PVP 0.5～2.0 g·L-1濃度內，褐化率隨濃度增加而顯著降低［18］。本研究中，在0～8 g·L-1PVP 濃度范圍內，各火力楠胚系褐化為害均先隨PVP 濃度增加而降低，到4 g·L-1時抗褐化效果顯著最佳，此后抗褐化效果趨于穩定，說明4 mg·L-1PVP 能有效地消除火力楠的褐化為害，PVP 用量較天女木蘭和景寧木蘭大得多。比較表3 和表6 可以看出，對于最佳抗褐化培養基LY 而言，添加PVP對于增殖芽數量效果不明顯，但能夠明顯提高增殖苗的抽高生長，表現在高3 cm 以上芽苗占比明顯增大，由15.2%～50.8%增至34.4%～75.8%。

生根是植物的一個復雜生理生化過程，多數木蘭科植物組培生根難［20］，其難易程度因樹種而異。李艷等添加NAA 1.0 mg·L-1在1/2MS 基本培養基上誘導白玉蘭、二喬玉蘭、紫玉蘭生根，生根率分別為68%、81%、43%［21］；利用1/2MS 基本培養基開展火力楠生根培養，柳曼瓊等添加細胞分裂素（ZT 0.5～0.6 mg·L-1）、生長素（NAA 1.5～2.0 mg·L-1、IAA 2～2.5 mg·L-1）以及椰乳（15%～20%）誘導生根，獲得約29.4%的生根率［9］，李雪等僅添加生長素（IBA 2.0 mg·L-1及NAA 3.0 mg·L-1）即獲得93.25%的生根率［10］，其生根難易程度差異可能與個體有關。這種現象在本研究中亦得到證實，在最佳處理（8.5 mg·L-1ABT 2 號生根粉）下，生根率為0%～93.6%，胚系間差異極顯著，可能與個體的遺傳基因有關。ABT 2 號生根粉的生根效果極顯著優于IBA，無論是ABT 2 號生根粉還是IBA，火力楠生根率隨著生根促進劑濃度的升高呈現先升高后下降的趨勢，在濃度為8.5 mg·L-1時生根效果最佳。究其原因，適宜濃度的IBA 有利于植株內源IAA 的合成，促進植物生根，過高濃度反而降低［22～23］；ABT 2 號生根粉為廣譜性生根劑［24］，其生根誘導效應亦是如此。

4 結論

應用0.1%升汞溶液消毒火力楠胚6～9 min，能成功獲得無菌胚系，其萌發率為60%～65%。采用LY 基本培養基，添加4 g·L-1PVP 進行增殖培養，能有效降低LY 培養基的褐化程度，促進瓶苗抽高生長，顯著提高生根瓶苗出苗率。采用8.5 mg·L-1ABT2 號生根粉進行生根培養，生根率可達93.6%。瓶苗移植成活率在80%以上?？偠灾?，本研究獲得以火力楠種胚為外植體的組培方案，為后續火力楠無性系組培研究和優質苗木生產奠定了基礎。