模擬氮沉降和不同外生菌根真菌侵染對樟子松幼苗生長的影響

王續富 郝龍飛 郝嘉鑫 郝文穎 包會嘎 白淑蘭*

（1. 內蒙古農業大學林學院，呼和浩特 010019；2. 烏海市濕地管理局，烏海 016000）

氮是植物生長的必需元素，也是植物體內眾多化合物的組成元素［1］。氮素在植物生長過程中起著重要作用，以往研究發現，外源氮的進入能促進氮素缺乏地區的植物生長，抑制氮素富集地區植物生長，并直接影響該地區的生態系統多樣性［2～4］。氮沉降是地球生態系統的氮素沉降到地表的過程［5］，氮沉降的加劇會造成微生物多樣性降低、土壤酸化和植物多樣性退化等生態問題［6］。有研究預測，到2030 年全球氮沉降總量將會達到50～80 Tg·a-1［7］。目前，我國已成為繼歐美的第三大氮沉降區，近年來，歐洲和美國的大氣氮沉降已基本得到控制，而我國氮沉降形勢依然嚴重［8～9］；相關研究表明，在2010 年我國華北平原大部分發達地區氮沉降量已高達30 kg·N·hm-1·a-1以上，在東北、華中和四川盆地等地區氮沉降也處于15～30 kg·N·hm-1·a-1的較高水平，且氮沉降量均有快速增加趨勢［10］。

根系是植物吸收養分的主要器官，根系形態和結構的變化直接影響著植物吸收氮素的效率，并對植物生長產生重要影響［11］。大多數植物對氮素的響應較為敏感，氮素進入土壤影響根系細根根尖變化，從而決定植物根系的死亡率和養分吸收能力；適量的氮素能促進植物根系的發育，而過量的氮素則會抑制其發育，同時氮素增加還會抑制細根根系分解，使得氮素滯留于土壤中［12～13］。較氮素對植物根系影響而言，外生菌根真菌（ecto?mycorrhizal fungi，ECMF）侵染植物根系形成的菌根以及其外延菌絲，會提高宿主植物根系對氮、磷等營養元素的吸收能力，并擴大根系的吸收范圍，同時植物也能通過菌根共生體與其他分解體競爭吸收土壤中的有效氮［14～15］。研究發現，氮素形態及土壤氮含量顯著影響菌根真菌侵染根系的能力［16］，銨態氮對歐洲赤松（Pinus sylvestris）外生菌根侵染率的影響顯著高于硝態氮［17］，而土壤氮含量的增加能夠提高缺氮地區菌根侵染率，降低氮富集地區的菌根侵染率［18～19］。外源氮添加對菌根的形成和功能產生一定抑制作用，過量的氮添加會減弱菌根真菌侵染植物根系的能力，進而影響寄主植物生長和氮、磷營養的吸收與利用［20］，同時氮含量增加還會降低植物根系比根長，并增加根系平均直徑［16］。

樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica）是我國北方主要造林樹種，也是一種典型的外生菌根依賴型樹種［21］。那么氮素對苗木生長、根系構型、以及菌根侵染率產生哪些影響？尤其在氮沉降背景下，探究不同氮濃度對樟子松菌根苗與非菌根苗生長、生物量分配、菌根侵染率以及根系形態的影響，從而探討氮沉降量增加對菌根苗木的作用機理，為全球變化背景下苗木生長響應提供參考依據。

1 研究材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1試供菌種

試供菌種為：褐環粘蓋牛肝菌（Suillus luteus）、厚環粘蓋牛肝菌（Suillus grevillea）、黃褐口蘑（Tri?choloma fulvum）、淺 灰 小 牛 肝 菌（Boletinus grisellus）、乳牛肝菌（Suillus bovinus）、球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）、淺黃根須腹菌（Rhi?zopogon luteolus）、彩色豆馬勃（Pisolithus tinctori?us），菌劑采用MMN 培養液與純蛭石制作固體培養基，對以上8個菌種進行菌劑制備。

1.1.2種子處理及苗木培育

樟子松種子用2%的KMnO4溶液消毒30 min，然后用無菌水沖洗4～5 次；在25℃恒溫光照培養箱中催芽，待種子萌發后播入裝有經高溫高壓滅菌基質（蛭石與土體積比為1∶1）的育苗盆中（d=15 cm），并置于人工氣候室培養（溫度25℃，最大濕度60%，最大光照強度10 000 lx）。

1.2 試驗設計

1.2.1接種處理設計

研究采用盆栽試驗，設置2 個接種處理和1 個對照處理，分別為：不接種處理（CK）、單接種乳牛肝菌處理（SB）、8 個菌種混合接種處理（HJ）。將上述培育2個月生長良好的幼苗進行接種；幼苗接種時，在育苗盆底部放入適量滅菌基質，然后選取長勢良好的菌劑均勻平鋪于滅菌基質上（基質同上處理）；將幼苗栽于其上并使根系盡量與菌劑充分接觸，每盆接種量30 g（混合接種時先取等量的各菌種菌劑均勻混合，然后進行接種）；每盆栽植5株幼苗，覆滅菌基質，每盆共重1.0 kg；對照處理加入經滅菌的等量相同固體菌劑，同樣方法進行幼苗栽植。

1.2.2模擬氮沉降處理設置

幼苗接種培養3 個月后，進行菌根侵染率測定，確定菌根形成后，將不同接種處理的育苗盆隨機排布，于2018年9月30日開始模擬氮沉降處理。根據試驗區氮沉降背景值34.3 kg·N·hm-1·a-1［8］，設置3組氮濃度處理：①未施氮處理（CKN，0 kg·N·hm-1·a-1）；②1 倍氮濃度處理（CN，30 kg·N·hm-1·a-1）；③2 倍氮濃度處理（2CN，60 kg·N·hm-1·a-1）。用自來水溶解NH4Cl和NaNO3（氮元素質量比1∶1）作為氮添加溶液，每盆15 d定量澆氮添加溶液150 mL，共施氮10 次。每組處理設置15 個重復，置于人工氣候室中，每盆5 d 定量澆水150 mL，每盆15 d 澆10%的Hogland營養液150 mL。

1.3 苗木各指標測定

1.3.1菌根侵染率測定

各處理苗木隨機選取3盆苗木，從每個盆中取1 株幼苗，將其根系清洗干凈后剪成1 cm 長的根段，共取50個根段，放入盛有少量去離子水的培養皿（d=90 cm）中，將培養皿置于體視顯微鏡下，采用觀測統計法測定菌根侵染率。

1.3.2幼苗生長指標測定

在試驗結束后，從各處理中取5 株幼苗，用游標卡尺測定株高和地徑，采用烘干法測定幼苗的地上和地下生物量。

1.3.3根系形態結構測定

最后施氮結束15 d 后，從各處理中取長勢較一致的樟子松幼苗3株，用去離子水清洗根系附著雜物后進行根系形態結構的測定。用Epson 數字化掃描儀Expression 10000XL 進行根系形態掃描，并用Win RHIZO 根系圖像分析軟件對各處理根系形態結構進行定量分析，測定根系平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數。

1.4 數據整理與分析

利用SPSS 24.0 對菌根侵染率進行單因素方差分析，對幼苗生長指標和根系形態分別進行單因素和雙因素方差分析，采用sigmaplot 10.0作圖。

2 結果與分析

2.1 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗菌根侵染率的影響

施氮前分別測定CK、SB 和HJ 處理的菌根侵染率，其中CK 處理未形成菌根，SB和HJ處理菌根侵染率分別為：31.55%，75.38%。施氮結束后測定CK 處理中的3 組氮濃度處理也均未形成菌根，HJ處理下各氮濃度菌根侵染率均顯著高于SB 處理下各氮濃度菌根侵染率。SB 和HJ 處理的菌根侵染率均隨氮濃度的增加而降低，且SB和HJ處理下CN 和2CN 間菌根侵染率無顯著差異；SB 處理下CN 和2CN 較CKN 處理分別顯著降低71.47%和71.47%（P<0.05），HJ處理下CN和2CN較CKN處理分別顯著降低13.33%和14.00%（P<0.05）（見圖1）。

2.2 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗生長及生物量的影響

通過幼苗生長指標及生物量進行雙因素方差分析，接種對樟子松幼苗的苗高、地徑、地上生物量和地下生物量均達到極顯著影響（P<0.01），氮濃度處理對幼苗的苗高、地徑無顯著影響，但對地上生物量和地下生物量影響達到極顯著和顯著水平，接種和氮濃度處理對苗高和地下生物量無交互作用，而對地上生物量和地徑交互作用達到極顯著和顯著水平（見表1）。從接種處理分析：同一氮濃度處理，SB和HJ處理中2CN 濃度處理下幼苗苗高顯著高于CK 處理，HJ 處理中CKN 和CN 濃度處理下地徑均顯著高于CK 處理，不同接種處理下各氮濃度地上和地下生物量均為：HJ>SB>CK。從氮濃度分析：CK、SB 和HJ 處理各氮濃度幼苗的苗高和地下生物量均無顯著差異；CK 處理下地徑和地上生物量均隨氮濃度增加而增加，SB和HJ處理下地上生物量均隨氮濃度增加有降低趨勢（見表1）。說明接種顯著影響樟子松幼苗生長，而短期的氮濃度對幼苗地上生物量影響最大。

2.3 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗根系形態結構的影響

表1 不同處理對樟子松幼苗生長及生物量的影響（13月齡）Table 1 Growth and biomass of P.sylvestris var.mongolica seedlings under different treatments（13 months old）

通過對幼苗根系形態結構進行雙因素方差分析表明，接種和氮濃度處理，以及兩者交互作用對幼苗的根系平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數均達到極顯著影響（P<0.01）（見表2）。從接種處理分析：HJ 處理幼苗根系的平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數均在CKN 濃度下顯著高于SB 和CK 處 理；SB 和HJ 處理幼苗 根 系的平均直徑、總根長和總表面積在CN 濃度下均顯著高于CK 處理，總分叉數無顯著差異；CK 處理下2CN 濃度根系的平均直徑顯著高于SB 和HJ 處理，SB 處理根系的總根長和總表面積在2CN 濃度下顯著高于CK 和HJ 處理。從施氮濃度分析：幼苗根系CK和SB 的根系平均直徑、總根長和總表面積均隨氮濃度增加而增加，SB 的總分叉數在CN 濃度最大，且與2CN 濃度無顯著差異；HJ 幼苗根系的平均直徑和總分叉數均隨氮濃度增加而減小，總根長和總表面積在CN 濃度最大（見表2）。由上可得，氮濃度增加能顯著增加CK 和SB 處理的根系形態結構，而對HJ處理產生抑制作用。

表2 不同處理對樟子松幼苗根系形態的影響Table 2 Root morphology of P. sylvestris var. mongolica seedlings under different treatments

3 討論

3.1 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗菌根侵染率的影響

以往研究表明，菌根侵染率隨土壤氮有效性的增加而降低［22］，也有研究發現，植物的菌根侵染率隨著土壤氮有效性的增加，其菌根侵染率不變或者增加［23～24］。本研究發現，SB 和HJ 處理下CN和2CN 濃度較CKN 濃度菌根侵染率均顯著降低，該結果符合成本—效益理論，即隨土壤氮有效性的增加，植物根系對菌根的依賴性降低，從而導致菌根真菌侵染率下降［25］；而CN 和2CN 濃度的菌根侵染率無顯著差異，以成本—效益理論分析，其原因可能是人工氣候室光照條件僅達到植物在CN濃度前的光合碳同化能力；隨氮濃度進一步增加，植物無法獲取更多的碳元素與從菌根獲得的氮元素形成有機物；進而導致光合產物限制了菌根侵染，而氮添加對菌根真菌的侵染產生限制作用。

3.2 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗生長及生物量的影響

本研究發現，接種較CK 處理均能顯著促進幼苗的地上和地下生物量，且HJ 處理對幼苗的促進作用最大，與以往關于植物接種菌根真菌后能夠顯著促進植物生長研究結果一致［26］。本研究中，接種較CK 處理均能顯著增加幼苗地徑，說明接種對幼苗有較好的促生效果，而對苗高基本無顯著影響。吳小芹等研究發現幼苗接種后顯著增加黑松（Pinus thunbergii）幼苗的苗高和地徑生長［27］，本實驗中苗高無顯著差異，可能與光照條件成為幼苗生長的限制因素有關。以往關于氮濃度對菌根與非菌根植物的研究發現，一定范圍的氮添加能夠促進非菌根苗地上生物量的積累并對地下生物量產生一定的抑制作用；但是氮添加對菌根植物的總生物量有一定抑制作用［17，28］，該結果與本研究中氮添加對不同接種處理研究的結果一致。隨著氮濃度的增加CK 處理的幼苗地上生物量顯著增加，而接種處理的地上生物量則顯著降低，原因可能是植物的生物量的積累在一定程度上由植物根系提供的氮素所決定。氮添加后，接種處理CN 和2CN 濃度的植物菌根侵染率較CKN 濃度顯著降低，因此CN 和2CN 濃度的植物根系吸收氮素能力較CKN 濃度有顯著降低，所以植物根系供給植物的氮素成為植物生物量積累的限制因子，使得接種處理的CN和2CN地上生物量顯著下降。

3.3 模擬氮沉降對不同接種處理幼苗根系形態結構的影響

根系是植物從土壤吸收養分和水分的重要器官［29］。研究中通常將根系的平均直徑、總根長、總根表面積以及分叉數等，作為評價根系養分吸收能力的重要指標。本研究中，與CK 和SB 處理下CKN 濃度相比，HJ 處理下根的平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數均有顯著增加；祁金玉等［26］研究中也得出了類似結論，但本研究中，SB 與CK處理下CKN 濃度相比，并未顯著增加幼苗根系形態結構各項指標，可能是因為SB 處理下的菌根侵染率不高所致。氮濃度對植物根系的影響中，CK和SB 處理各氮濃度中，幼苗根系的平均直徑、總根長、總表面積隨著氮濃度的增加均顯著增加，說明當外界土壤氮素含量較高時，非菌根苗以及菌根侵染率低的菌根苗木根系會通過優化形態結構增加平均直徑、總表面積等，以增加根系養分運輸的能力［30～31］。在菌根侵染率高的HJ 處理中，2CN濃度下根系的平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數較CKN 濃度顯著下降。其原因可能是：根系菌根侵染率較高時，在外界氮進入土壤后，根系對外生菌根的依賴性降低，使得菌根共生體發生退化；因此HJ 處理中與CKN 和CN 濃度相比，2CN 濃度降低了幼苗根系各形態結構指標。

4 結論

（1）接種乳牛肝和混合接種處理，隨氮濃度的增加，苗木菌根侵染率呈下降趨勢，其中2 種氮濃度處理下菌根侵染率分別顯著低于對照，而2種氮濃度處理間無顯著差異。

（2）接種能顯著促進樟子松幼苗的生長。但隨著氮濃度的增加，對非菌根苗地上生物量有促進作用，而對菌根苗地上生物量的積累有抑制作用。接種和氮濃度對幼苗苗高和地下生物量無交互作用，對地徑和地上生物量交互作用達到顯著和極顯著差異。

（3）土壤氮有效性增加能夠促進非菌根苗和侵染率較低的苗木根的平均直徑、總根長和總表面積，但是對于侵染率較高的菌根苗則會產生抑制作用。接種和氮濃度對幼苗根系平均直徑、總根長、總表面積和總分叉數交互作用均達到極顯著差異。