氮沉降及菌根真菌對長白落葉松苗木根系構(gòu)型及根際酶活性的影響

劉婷巖 郝龍飛* 王續(xù)富 閆海霞 白淑蘭

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，呼和浩特 010019；2. 呼和浩特市環(huán)境監(jiān)測中心站，呼和浩特 010030）

土壤氮有效性是氣候變化反饋機制的重要因子，同時也是影響植物生長和物種多樣性的關(guān)鍵因素［1］。由于人類活動產(chǎn)生的活性氮不斷增加，并以干、濕沉降的方式進入地球表面，導(dǎo)致了一系列的生態(tài)問題，當前中國已成為全球氮沉降最高的國家之一［2］。已有研究認為，氮沉降已成為影響中國陸地生態(tài)系統(tǒng)平衡的主要驅(qū)動因子，進而影響森林生態(tài)系統(tǒng)土壤微生物多樣性及生態(tài)功能［3～4］。以往研究發(fā)現(xiàn)，菌根共生關(guān)系受到氮沉降的影響，土壤氮限制地區(qū)的外源氮輸入會促進菌根的生長，但隨著氮輸入量的增加，對菌根共生體的影響存在差異，差異程度取決于生態(tài)系統(tǒng)中氮沉降量及時間、土壤初始氮水平和菌根類型等因素［5］。

土壤酶作為生態(tài)系統(tǒng)的生物催化劑，且對外界環(huán)境變化非常敏感，其中β-1，4 葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖氨糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）分別在土壤的碳、氮、磷養(yǎng)分循環(huán)利用中起著重要作用［6］。氮沉降作為外源氮進入生態(tài)系統(tǒng)，顯著影響土壤酶在生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)過程中的作用［7］。以往關(guān)于氮輸入對土壤酶的影響有促進［8］、抑制［9］和無影響［10］等不同結(jié)論，原因為土壤酶在不同環(huán)境中對氮沉降的響應(yīng)存在差異。土壤酶主要來源于土壤微生物和植物根系，以往關(guān)于氮沉降對菌根真菌和土壤酶兩者的單一研究已有大量的報道［11］；且研究也發(fā)現(xiàn)，菌根共生體顯著影響土壤酶的活性［12］。然而，菌根共生體形成后，其根際土壤酶活性對氮沉降的響應(yīng)研究較為缺乏。

本研究以北方地區(qū)菌根依賴型樹種長白落葉松（Larix olgensis）苗木為材料，通過對比分析氮沉降對菌根苗和非菌根苗根系形態(tài)變化，結(jié)合氮沉降處理下土壤酶活性的變化規(guī)律，探討氮沉降對生態(tài)系統(tǒng)植物根系和菌根真菌共生關(guān)系中根系構(gòu)型和酶活性特征的影響，為全球變化背景下森林生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性研究提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究所用外生菌根真菌為：褐環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus luteus）、厚環(huán)粘蓋牛肝菌（Suillus grevillei）、黃褐口蘑（Tricholoma fulvum）、淺灰小牛肝菌（Bo?letinus grisellus）、乳牛肝菌（Suillus bovinus）、球根白絲膜菌（Leucocortinarius bulbiger）、淺黃根須腹菌（Rhizopogon luteolus）和彩色豆馬勃（Pisolithus tinctorius）。

長白落葉松種子用2%的KMnO4溶液消毒30 min，然后用無菌水沖洗4～5 次；在25℃恒溫光照培養(yǎng)箱中催芽，待種子萌發(fā)后播入裝有經(jīng)高溫、高壓滅菌基質(zhì)（蛭石與土體積比為1∶2）的花盆中（d=15 cm），并放入人工氣候室培育（溫度25℃，最大濕度60%，最大光照強度10 000 Lux）培養(yǎng)2 月后待用。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1菌劑制備

菌劑采用MMN 培養(yǎng)液與蛭石配置成固體培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌1 h，待冷卻后分別接種上述8種外生菌根真菌的平板菌種，再置于25℃培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，45 d后即可長滿瓶，以備用。

1.2.2接種處理

研究采用盆栽試驗，設(shè)置2 個接種處理，分別為接種處理（以下簡稱+M，將8種菌劑等量混合后對幼苗進行接種）和未接種處理（以下簡稱-M）。接種方法為：在育苗盆底部放入適量滅菌基質(zhì)，然后選取長勢良好的菌劑等量混勻平鋪于滅菌基質(zhì)上，再選培養(yǎng)2 個月生長良好的幼苗栽入其中，盡量使幼苗根系與菌劑充分接觸，每盆接種量20.0 g，每盆栽植5 株幼苗，覆滅菌基質(zhì)，每盆質(zhì)量控制1.0 kg；對照處理加入經(jīng)滅菌的20.0 g 等量混合的固體菌劑，同樣方法進行幼苗栽植，澆透水后，將不同處理育苗盆隨機排布，置于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗苗圃溫室大棚內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3模擬氮沉降處理試驗

幼苗接種培養(yǎng)2 個月后，測定+M 處理苗木菌根侵染率達38.57%（-M 處理苗木菌根侵染率為0%），開始模擬氮沉降處理試驗。根據(jù)試驗區(qū)氮沉降背景值34.3 kg·N·hm-1·yr-1［8］，設(shè)置4 個氮濃度處理：不施氮（0N，0 kg·N·hm-1·yr-1）、低氮（LN，15 kg·N·hm-1·yr-1）、中氮（MN，30 kg·N·hm-1·a-1）和高氮（HN，60 kg·N·hm-1·a-1）處理。用自來水溶解的NH4Cl 和NaNO3（NO3-：NH4+為1∶1）作為氮添加溶液，隔5 d 定量澆水150 mL/盆、隔10 d 定量施入氮添加溶液100 mL/盆，共施氮10次。接種和氮沉降處理各設(shè)置15個重復(fù)。采用噴灑方法將氮施入育苗盆中，既可以模擬降雨過程脈沖式將氮帶入土壤中，同時更為均勻。

1.3 根系形態(tài)測定

最后一次模擬氮沉降試驗結(jié)束15 d 后，從各處理中隨機選取長勢較一致的長白落葉松幼苗5株，用去離子水清洗根系附著雜物后進行根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的測定。用Epson 數(shù)字化掃描儀Expres?sion10000XL 進行根系形態(tài)掃描，并使用Win RHI?ZO 根系圖像分析軟件對各處理根系形態(tài)結(jié)構(gòu)進行定量分析，測定直徑0～0.5 mm根系的總根長、總表面積、總體積、根尖數(shù)等形態(tài)指標。

1.4 土壤酶活性測定

土壤酶活性的測定包括β-1，4-葡萄糖苷酶（BG）、β-1，4-N-乙酰-氨基葡糖氨糖苷酶（NAG）、亮氨酸氨基肽酶（LAP）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP），具體測定參考Sinsabaugh 等的方法［13］。BG、NAG、ACP 的測定，根據(jù)預(yù)實驗準確稱取0.25 g 新鮮土壤，加入不同的4 mL 醋酸緩沖液配制的不同反應(yīng)底物溶液，20℃培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，提取上清液2.5 mL 于試管中，加入NaOH 終止反應(yīng)和顯色，在410 nm 處測定吸光度。ALP 酶和LAP 測定方法與上述酶測定相似，分別準確稱取0.25和0.35 g新鮮土樣，并分別采用碳酸鹽緩沖液和Tris-羥甲基-氨基甲烷緩沖液配制相應(yīng)底物溶液，LAP 反應(yīng)4 h 后不加NaOH，直接測定吸光度，以對硝基苯酚的濃度表征酶活性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0（SPSS for Windows，Chicago，USA）采用雙因素方差分析和LSD 多重比較法對接種菌根真菌和氮沉降處理下苗木根系形態(tài)和土壤酶差異顯著性進行檢驗。采用Sigmaplot10.0（Systat Software Inc.，San Jose，CA，USA）進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮沉降和接種處理對苗木根系形態(tài)的影響

對1 年生長白落葉松苗木根系形態(tài)進行雙因素方差分析，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用對苗木直徑0～0.5 mm根系的總根長、總表面積、總體積、根尖數(shù)的影響均達到極顯著水平（P<0.01）（見表1）。在+M 和-M 處理中，長白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)指標均隨氮沉降量遞增呈下降的趨勢。0N 處理苗木直徑0～0.5 mm 根系形態(tài)指標均顯著高于MN 和HN。在0N、MN處理下，-M處理的總根長、總表面積、總體積、根尖數(shù)均顯著高于+M 處理。-M 處理下，LN 處理的直徑0～0.5 mm 根系總根長和根尖數(shù)較0N 處理分別降低了18.9%（P<0.05）和53.3%（P<0.05）。而HN 處理下，+M 處理根系的根尖數(shù)較-M 處理降低了32.1%（P<0.05）（見表1）。

2.2 氮沉降和接種處理對幼苗根際土壤酶活性的影響

對1 年生長白落葉松苗木根際土壤酶活性進行雙因素方差分析，接種菌根真菌顯著影響苗木根際BG、LAP、ALP 和NAG 活性（P<0.01），但對ACP 活性無顯著影響。氮沉降對苗木根際土壤酶活性的影響均達到了極顯著水平（P<0.01）。接種菌根真菌和氮沉降處理對ACP 無交互作用，而對BG、LAP、ALP和NAG活性的影響達到極顯著和顯著水平（見表2）。隨氮沉降量遞增，長白落葉松苗木根際土壤中BG、LAP、ACP和ALP活性均呈先增加后下降的趨勢，而NAG 活性呈下降的趨勢。+M處理苗木根際土BG 活性顯著高于-M 處理。0N 條件下，+M 與-M 相比根際土壤NAG 活性提高了74.7%（P<0.05）；LN 條件下，+M 處理苗 木根際土壤LAP 活性較-M 處理提高了83.2% （P<0.05）；MN 條件下，+M 處理根際土壤ACP 活性較-M 處理提高了17.6%（P<0.05）；但+M 處理根際土壤ALP 活 性 較-M 處 理 降 低 了32.2%（P<0.05）（見表2）。

表1 氮沉降和接種菌根真菌對長白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)的影響Table 1 Root morphology with diameter of 0-0.5 mm of L. olgensis seedlings under nitrogen deposition and inoculated with ectomycorrhizal fungi treatments

表2 氮沉降和接種菌根真菌對長白落葉松幼苗根際土壤酶活性的影響Table 2 Rhizosphere soil enzyme activities of L. olgensis seedlings under nitrogen deposition and inoculated with ecto‐mycorrhizal fungi treatments（nmol·g-1·h-1）

2.3 根系形態(tài)和土壤酶活性間相關(guān)性分析

兩種接菌處理下，長白落葉松苗木直徑0～0.5 mm 根系的形態(tài)指標與根際土壤BG 活性呈負相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；除根尖數(shù)與根際土壤NAG 活性間無顯著相關(guān)性外，其他根系形態(tài)指標與NAG 活性均呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.05）；-M 處理下根際土壤LAP 活性與總根長、總表面積和根系總體積呈顯著正相關(guān)（P<0.05）。接種菌根真菌和氮沉降交互作用的影響下，根系形態(tài)指標與根際土壤BG 活性呈顯著負相關(guān)（P<0.01）；除根尖數(shù)與根際土壤ACP 活性顯著負相關(guān)性外（P<0.05），其他根系形態(tài)指標與ACP 活性無相關(guān)性；除根尖數(shù)與根際土壤ALP 活性無顯著相關(guān)外，其他根系形態(tài)指標與ALP活性均呈正相關(guān)（P<0.05）（表3）。

表3 接種菌根真菌處理下長白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)與根際土壤酶活性相關(guān)性分析Table 3 Pearson’s correlation test between root morphology with diameter of 0-0.5 mm and rhizosphere soil enzyme activities of L.olgensis seedlings under inoculated with ectomycorrhizal fungi treatments

3 討論

3.1 氮沉降和接種處理對苗木根系構(gòu)型的影響

外生菌根真菌侵染植物根系，形成菌根共生體，增大根系吸收面積，促進了植物對水分和養(yǎng)分的吸收，尤其對外生菌根依賴型樹種，共生關(guān)系形成后，提高植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)性［14］。根系形態(tài)構(gòu)型中根系長度、表面積、體積、根尖數(shù)是衡量植物根系分布范圍和養(yǎng)分吸收能力的重要指標。本研究中，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用對苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)的影響均達到極顯著水平（P<0.01），且不同接種處理下長白落葉松苗木根系指標均隨氮沉降量遞增呈下降的趨勢，且-M 處理高于+M 處理（見表1）。與以往關(guān)于施用氮肥對落葉松人工林1 級根外生菌根侵染及形態(tài)的影響研究結(jié)果一致［15］，原因可能為植物對環(huán)境變化具有較強的適應(yīng)性和可塑性，一定的氮沉降處理消除了土壤氮限制，植物通過調(diào)節(jié)細根的生長形成最優(yōu)的資源獲取策略［16］。在相同氮沉降處理下，-M處理的總根長、總表面積、總體積、根尖數(shù)均高于+M 處理（見表1）。與以往研究關(guān)于外生菌根真菌提高油松根系構(gòu)型的形態(tài)指標的研究結(jié)果存在差異［14］，其原因可能為菌根共生體中棒狀和二叉狀結(jié)構(gòu)提高了吸收根直徑［17］，導(dǎo)致接種處理下直徑0～0.5 mm 根系中吸收根的根尖數(shù)減少；也可能植物菌根形成后，一部分碳水化合物分配給菌根真菌，自身根系形態(tài)構(gòu)型指標降低，該觀點也符合植物生長策略［16］。

3.2 氮沉降和接種處理對根際土壤酶活性的影響

土壤酶活性與土壤養(yǎng)分循環(huán)密切相關(guān)，且高氮輸入對森林生態(tài)系統(tǒng)平衡產(chǎn)生顯著影響［18］。本研究發(fā)現(xiàn)，氮沉降對苗木根際土壤酶活性的影響均達到了極顯著水平；而接種菌根真菌及其交互作用顯著影響苗木根際土壤BG、LAP、ALP和NAG活性，而對ACP 活性無顯著影響。同時，隨氮沉降量遞增，長白落葉松菌根和非菌根苗根際土壤酶（BG、LAP、ACP 和ALP）活性均呈先增加后下降的趨勢，而NAG 活性呈下降的趨勢（見表2）。與以往關(guān)于氮沉降對廣東鼎湖山林地土壤酶活性的影響結(jié)果一致［19］，原因可能為低氮水平緩解了土壤氮限制，促進根系和微生物活性，進而增加了土壤酶活性；而高氮處理可能導(dǎo)致嚴重的土壤酸化［20～21］，影響土壤微生物活性，進而導(dǎo)致高氮處理下土壤酶活性受到限制。本研究也發(fā)現(xiàn)，隨氮沉降量增加，+M 處理根際土壤酶活性變化量高于-M處理（見表2），表明氮沉降對菌根苗根際土壤酶活性的影響高于非菌根苗。原因可能為HN處理下，根系較容易獲得養(yǎng)分，對菌根真菌的依賴性降低，削弱根系和菌根真菌的共生關(guān)系［22］。氮沉降處理下，+M 和-M 處理長白落葉松苗木直徑0～0.5 mm根系形態(tài)與根際土壤BG 活性呈顯著負相關(guān)（P<0.05），表明氮沉降下根系形態(tài)指標降低而土壤BG活性增加。原因為土壤BG 主要來源于土壤微生物［23］，氮添加會增加土壤中氮含量、纖維素和半纖維素的濃度，降低木質(zhì)素和糖類濃度，所以氮添加會促進纖維素降解酶（BG）活性［24］。根據(jù)資源配置理論，氮沉降增加土壤無機氮的濃度，土壤微生物可能會減少氮獲取酶的產(chǎn)生，以往的研究大多使用資源分配理論來解釋氮獲取酶對氮添加的響應(yīng)，與本研究結(jié)果根際土壤NAG 活性變化規(guī)律結(jié)果一致。研究也發(fā)現(xiàn)，當營養(yǎng)限制發(fā)生變化時（如從N 限制到P 限制），根系和微生物可能會調(diào)整相關(guān)酶的產(chǎn)生，以保證植物和微生物平衡養(yǎng)分需求與周圍環(huán)境供應(yīng)之間的動態(tài)平衡［25］。

4 結(jié)論

（1）除土壤酸性磷酸酶外，接種菌根真菌、氮沉降及二者交互作用顯著影響苗木直徑0～0.5 mm根系的形態(tài)及根際土壤酶活性。

（2）苗木形成菌根后可以減弱氮沉降對苗木根系構(gòu)型的影響，尤其在低氮濃度下，菌根苗對根際土壤酶的活化程度顯著高于非菌根苗。

（3）高氮濃度顯著抑制菌根苗和非菌根苗吸收根根系形態(tài)構(gòu)型。

（4）隨著氮濃度的增加，長白落葉松菌根苗顯著提高根際土壤相關(guān)酶（BG和NAG）的活性。