藤本月季“安吉拉”花芽分化形態結構及內源激素變化研究

劉智媛 曾 麗 杜習武 彭勇政 陶懿偉 李雨清 秦 俊

（1. 上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2. 上海辰山植物園，上海 201602；3. 上海城市樹木生態應用工程技術研究中心，上海 200020）

藤本月季“安吉拉”（Rosa cv.‘Angela’）為多年生薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）植物，因其觀賞性及抗性強廣泛應用于城市園林綠化中，是優良的城市垂直綠化植物材料［1］。狹義的花芽分化指的是植物從營養生長轉向生殖生長，進而發育成花器官原基雛形的過程［2～3］，而廣義的花芽分化則將其分為生理分化階段、形態分化階段和性細胞分化成熟階段3 個階段［4］。植物的花芽分化過程受到內部及外部環境的影響，主要包括基因調控、營養物質、內源激素及外界環境等因素［5］。內源激素與花的生長發育密切相關，在植物花芽分化過程中起到重要作用，也是前人研究花芽分化的主要途徑之一。前人在植物花芽分化及內源激素動態變化研究較多，主要集中在梨、桃、柑橘、葡萄、杏、荔枝等果樹方面的研究［6］；有關薔薇科薔薇屬植物的相關研究，主要對小姊妹月季花、玫瑰、單葉薔薇及月季“芬得拉”的花芽分化的形態結構進行了初步研究［7～10］，但有關藤本月季“安吉拉”花芽分化及內源激素的相關研究尚未見報道。

本研究以藤本月季“安吉拉”為試驗材料，通過石蠟切片和體視顯微鏡觀察花芽分化不同階段形態結構，同時通過聯酶免疫法測定其內源激素，研究花芽分化過程的形態結構及內源激素的變化，為調控藤本月季“安吉拉”開花數量、開花質量和開花時間提供理論數據，為藤本月季在園林景觀中進一步發展和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藤本月季“安吉拉”，來自上海辰山植物園，進行常規養護管理。

1.2 試驗方法

1.2.1花芽分化形態結構觀察

體視顯微鏡觀察：從2019 年3 月20 日開始每5 d采取藤本月季“安吉拉”新梢頂芽，隨機取20個新梢頂芽，利用鑷子剝去其外部幼葉，放于Olym?pus SZX16 體視顯微鏡下進行解剖觀察，對其花芽分化不同時期進行拍照記錄。

石蠟切片法觀察：新生枝條中選擇10～20 個新梢頂芽放于FAA 溶液中固定24 h，進行脫水，透明，浸蠟，包埋，修塊等步驟后，用萊卡Leica2245切片機進行切片，切片厚度為8～10 μm，切片后放置于萊卡H1220 烘片臺烘片，至條帶完全展開后，用蘇木精/伊紅溶液進行染色，置于Olmypus BX41生物顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.2.2聯酶免疫法測定內源激素

采集不同花發育時期新梢頂芽，首先在體視顯微鏡下觀察判斷不同花芽分化時期，再分別將不同花芽分化時期的花芽放入冰盒中，用液氮速凍，置于-80℃冰箱中。分別稱取不同花芽分化時期的去除幼葉的頂芽0.1 g，加1 mL 樣品提取液（磷酸緩沖溶液，pH7.4），2 000～3 000 r·min-1離心20 min，收集上清液于4℃冰箱待測。

試劑盒及試驗方法由上海酶聯生物公司提供，用純化的植物內源激素捕獲抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被的微孔中分別加入不同花芽分化時期的待測液10 μL，加入稀釋液40 μL。隨后加入辣根過氧化物（HRP）酶標記的檢測抗體100 μL，形成抗體—抗原—酶標抗體復合物，置37℃烘箱中培育60 min。經過徹底洗滌后加3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺（TMB）底物A 液和B 液各50 μL 顯色，37℃避光顯色15 min。加入顯色劑HRP 酶50 μL 轉化成黃色后用酶標儀在450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），通過繪制標準曲線計算待測樣品內源激素含量（ng·g-1FW）。

1.3 數據分析

采用SPSS22.0 進行數據分析，使用SigmaPlot 14.0軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 藤本月季“安吉拉”花芽分化過程

采用體視顯微鏡和石蠟切片觀察藤本月季“安吉拉”花芽分化的過程（見表1，圖1～2）可分為5個時期，共歷時30 d。2019年3月20日仍處于形態分化期（Ⅰ），5 d 后開始進入萼片原基分化期（Ⅱ），在生長錐邊緣開始出現萼片原基分化，隨后分別進入花瓣原基分化期（Ⅲ）和雄蕊原基分化期（Ⅳ），花瓣原基與雄蕊原基幾乎同時圍繞生長錐進行輪狀分化，最后進入雌蕊原基分化期（Ⅴ），扁平的生長錐頂端突起分化出多個雌蕊原基，2019年4 月20 日左右完成花器官原基雛形成過程。不同花芽分化時期形態特征如下：

形態分化期：3 月中下旬，通過石蠟切片在顯微鏡下觀察發現幼葉包裹的圓錐狀突起結構（見圖2A），即為生長錐，此時葉芽和花芽從外觀結構上無明顯差別。在體視顯微鏡下解剖該時期新梢頂芽，也可見明顯綠色的凸起（見圖1A）。

表1 藤本月季“安吉拉”花芽分化進程Table 1 Process flower bud differentiation in Rosa‘An‐gela’

萼片原基分化期：為3月底至4月初，生長錐變扁平，并于生長錐周圍產生5個小突起，為萼片原基（見圖1B～C，圖2B），不同萼片原基形成時期及大小不一致，分化完成后5個萼片原基大小基本一致。

花瓣原基分化期：為4月上旬，已分化出的5個萼片原基不斷向上伸長變寬，同時萼片原基內方開始出現花瓣原基的突起（見圖1D，圖2C），且突起數目不斷增多，以輪狀形式排列（見圖1E，圖2D）。

雄蕊原基分化期：為4月上、中旬，花瓣原基內側開始產生突起（見圖1F，圖2E）即為雄蕊原基，萼片原基和花瓣原基不斷伸長，雄蕊原基數目增多（見圖1G），在外輪雄蕊原基的下方繼續分化成數輪雄蕊原基（見圖1H）。

雌蕊原基分化期：為4 月下旬，雌蕊原基分化較雄蕊分化時期晚，雄蕊原基大量分化后，雄蕊原基頂部分化形成花藥，中下部分化成為花絲，生長錐頂端繼續變寬平，其上開始產生多個突起（見圖1I～J，圖2F），即雌蕊原基開始分化，隨后生長錐向下凹陷，花托邊緣向上伸長，雌蕊原基位于花托中，且彼此分離（見圖2G），完成了花器官原基雛形的分化。

隨花發育雄蕊原基逐漸伸長（見圖1J），花絲著生于花托邊緣，形成具多個雄蕊的雄蕊群。雌蕊原基頂端也逐漸分化成柱頭，中部延長形成花柱，基部膨脹為子房，形成多個彼此分離的雌蕊群，著生于瓶裝花托中（見圖2H）。

2.2 花芽分化過程內源激素的變化

由圖3可看出，花芽分化過程中脫落酸（ABA）濃度總體呈先上升后下降的趨勢，萼片原基分化期ABA 濃度最高，為25.41 ng·g-1FW，但與花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期無顯著差異；雌蕊原基分化期ABA 濃度最低，為19.77 ng·g-1FW，且顯著低于其他時期。

赤霉素（GA）濃度隨花芽分化呈逐漸下降的趨勢，形態分化期GA 濃度最高，為12.28 ng·g-1FW。萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期GA 濃度無顯著差異。雌蕊分化期時GA濃度最低，為9.20 ng·g-1FW，顯著低于其他時期。

細胞分裂素（CTK）濃度變化與ABA 相似，總體呈先上升后下降的趨勢，萼片原基分化期CTK濃度最高，為15.04 ng·g-1FW，與花瓣原基分化期以及雄蕊原基分化期無顯著差異。CTK 濃度在雌蕊原基分化期達到最低，為12.70 ng·g-1FW，顯著低于其他分化時期。

生長素（IAA）濃度變化呈逐漸上升趨勢，形態分化期最低，為660.74 ng·g-1FW；萼片原基分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期IAA濃度逐漸升高，但彼此無顯著差異；雌蕊原基分化期IAA濃度最高，為964.18 ng·g-1FW，顯著高于其他分化時期。

2.3 激素平衡與花芽分化的關系

圖4 可看出，CTK/GA 形態分化期時比值最低，為1.01，萼片原基分化期時比值顯著升高，與形態分化期差異顯著，與花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期無顯著性差異，雌蕊原基分化期時比值最高，為1.65，顯著高于其他分化時期。

IAA/GA 比值呈逐漸上升的趨勢，在形態分化期最低，為54.03，顯著低于雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。在雌蕊原基分化期時顯著增高，且高于其他時期，比值為106.24。

IAA/ABA 的比值總體呈逐漸上升的趨勢，在萼片原基分化期最低，但與形態分化期、花瓣原基分化期和雄蕊原基分化期無顯著性差異。在雌蕊原基分化期時顯著增高，且高于其他時期，比值分別49.23。

（CTK+ABA）/GA 比值在形態分化前期時最低，為2.84，萼片原基分化期時比值顯著升高，與形態分化期差異顯著，與花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期無顯著性差異，雄蕊原基分化期時比值最高，為3.83。

3 討論

3.1 月季花芽分化形態結構研究

前人研究發現月季的花芽分化呈螺旋狀，即先萼片，再花瓣、其次是雄蕊，最后是雌蕊的順序，且花瓣幾乎與最初的雄蕊同時開始分化［8，11］。本研究發現藤本月季“安吉拉”花芽各部分分化順序由外向內進行，花芽分化分為5 個時期，生長錐呈圓錐狀突起為形態分化期；生長錐逐漸變寬圓，在生長錐周圍出現5個萼片原基分化期；萼片原基內方分化出花瓣原基，即為花瓣原基分化期；花瓣原基內方分化出多個雄蕊原基，為雄蕊原基分化期；生長錐繼續變寬，從扁平的生長錐頂端形成多個突起為雌蕊原基，即為雌蕊原基分化期，花芽分化過程歷時30 d，藤本月季“安吉拉”花芽分化順序與前人研究結果一致。關于月季花芽分化過程的分期研究，馬子俊根據花芽的形態變化，將苦水玫瑰分化過程分為3 個階段［8］；王瑞勤等認為玫瑰的花芽分化開始于混合芽完成營養生長階段之后，并將玫瑰的分化過程分為8個時期［12］；賀海洋等利用石蠟切片方法將單葉薔薇的花芽形態劃分為6個時期，分別為形態分化前、苞葉原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期［7］。胡祖坤通過石蠟切片觀察，將小姊妹月季花芽分化時期詳細分為了16 個時期［10］；Maas等通過掃描電鏡和光學顯微鏡研究Ro?sa‘Mercedes’的花芽分化時期，將其分為9 個時期［13］；范天剛等將月季‘芬得拉”花芽分化進程劃分為5 個階段，分別為萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期和分化完成期［9］，本研究結果與范天剛研究結果相似。

3.2 花芽分化過程內源激素含量變化

ABA 可加快有機物在地上部分的積累及植物的分化速度，有利于花芽分化［14］。本研究發現萼片原基分化時期ABA 含量達最高，顯著高于形態分化期，到雌蕊原基分化期其含量則為最低，顯著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，與前人研究相似，說明ABA 對藤本月季“安吉拉”的花芽分化具促進作用。

CTK 能促進花芽形態分化，較高的CTK 水平能促進細胞分裂，打破生長錐的頂端優勢，解除腋芽的抑制，促進生長錐的分化［15～16］。本研究中CTK變化與ABA 變化相似，萼片原基分化時期含量最高，顯著高于形態分化期，雌蕊原基分化期其含量顯著低于雄蕊原基分化期及花瓣原基分化期，與前人研究相似，說明較高的CTK 含量有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

GA 有效抑制RNA 合成，抑制成花基因的表達，從而減緩植物花芽分化進程［17］。本文研究結果表明GA 在藤本月季“安吉拉”形態分化期含量最高，顯著高于其他分化時期，隨花芽分化進程GA 不斷下降，雌蕊原基分化期其含量最低，GA 含量的降低有利于藤本月季“安吉拉”花芽的分化。

IAA 的相關研究一直存在爭議，樊衛國等認為較低IAA含量有利于刺梨的花芽分化［18］，而Costanti?ni，E通過基因轉入手段證實IAA促進葡萄品種“湯姆遜無核”的花序形成［19］。本研究發現IAA的濃度在形態分化期時顯著低于其他時期，隨后IAA含量逐漸上升，并在雌蕊原基分化達到最高，說明較低IAA濃度有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化。

3.3 內源激素平衡與花芽分化的關系

Nooden 等認為激素保持一定的平衡狀態才能有效調控植物的生長發育以及花芽分化［20］。目前，越來越多的學者把關注點放在激素平衡與花芽分化關系中，提出了CTK/GA、IAA/ABA、（ZR+ABA）/GA、IAA/GA 等激素之間的平衡關系，花序誘導中需要較低的IAA/GA 比值，較高的IAA/ZR含量有利于花序形成，ZR/GA 和（ZR＋ABA）/GA比值上升，可促進植物花芽分化進程［21～22］。本研究結果顯示，CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值在形態分化期時最低，萼片原基分化期顯著高于形態分化期，說明萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高與花芽分化誘導有關，使植物由營養生長向生殖生長轉變，進入花芽分化階段；IAA/GA 和IAA/ABA 比值在形態分化期最低，隨花芽分化進程逐漸升高，在雌蕊原基分化期增加顯著，且高于其他時期，說明IAA/ABA 和IAA/ABA的升高可促進花器官原基的進一步發育，這與前人研究結果相似。

4 結論

本文通過體視顯微鏡及石蠟切片法將藤本月季“安吉拉”花芽分化過程共分為5 個時期，歷時30 d，分別為形態分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期。不同花芽分化時期內源激素的測定結果表明，ABA、CTK 濃度在萼片原基分化期顯著升高與花芽分化誘導有關，較低的IAA 濃度以及GA 濃度的降低有利于藤本月季“安吉拉”的花芽分化；萼片原基分化期CTK/GA 和（ABA+CTK）/GA 比值升高與花芽分化誘導有關，高水平的IAA/ABA 和IAA/GA比值與花器官原基的進一步發育相關。

月季花芽分化是一個十分復雜的過程，環境變化、基因調控、營養物質積累、外源激素的施用均會影響月季花芽分化，但具體的調控機制及相關影響因子還有待進一步研究。