14種石斛屬（蘭科）植物的花粉團形態及分類學意義

王艷萍 李 璐 楊晨璇 羅 艷 李青青

（1. 西南林業大學云南生物多樣性研究院，昆明 650224；2. 西南林業大學生命科學學院，昆明 650224；3. 中國科學院西雙版納熱帶植物園園林園藝部，勐臘 666303）

石斛屬（Dendrobium Swartz）是蘭科植物的第二大屬，有1 100～1 500 種，廣泛分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區以及大洋洲［1～3］。石斛屬是一類多年生附生蘭，具有以下典型分類學特征：側生花序從莖干上部的葉腋里長出，花大而艷麗，2 枚側花萼和蕊柱足愈合形成萼囊，具有4枚裸花粉團（na?ked pollinium，即無附屬物的花粉團）。由于物種數目龐大、花形態變異較大、物種間存在著形態重疊或過渡、地理分布廣，長期以來，石斛屬的分類學是蘭科中比較復雜的系統學問題，主要集中在屬內亞屬、組和物種劃分等方面［4～6］。自1799 年Swartz 建立石斛屬以來［7］，形態學分類修訂［8～11］和分子系統學研究不斷涌出［5，12～16］，表現為新種發表，舊種合并；舊組合并，新組設立，產生大量異名［17］，為該屬的物種劃分鑒定帶來困難。其中，最近的分子系統學研究把厚唇蘭屬（Epineneium）和金石斛屬（Flickingeria）等近緣類群也并入石斛屬，建立了單系的廣義石斛屬（Dendrobium s.l），可分為兩大支：亞洲分支（Asian clade）和澳大利亞分支（Australasian clade）［12，18～19］。與此同時，中國石斛屬也面臨著相似的分類系統問題，曾被分為12個組，包括74 種2 變種［20］，后來經過舊種合并與新種成立和發表等分類學工作，被修訂為78 種和14個組，增加了2 個組，包含了14 個中國特有種［2］。近10年來，隨著新種發表和新紀錄報道，我國石斛屬的物種數目已達110種［21］，然而屬下分類系統尚未開展研究。

已有研究表明，蘭科花粉表面紋飾特征在不同類群中變化明顯，具重要的系統分類學意義［22～30］。杓蘭亞科（subfam.Cypripedioideae）的成熟花粉以粘狀的單粒花粉散粉，其花粉表面紋飾以光滑型或光滑不平整型為主［26，31～32］。鳥巢蘭族（trib.Neottieae）散粉時為單粒或四合花粉形式，花粉表面紋飾以粗網紋狀為主［22，33］。南美分布的樹蘭亞科的一個亞族（subtrib.Pleurothallidinae）的21個屬的花粉團表面紋飾以光滑型為主，帶有不同程度的顆粒狀突起、穴狀凹陷等分化不明顯的特征［29］。然而，相對于物種數目達26 000 種的蘭科大家族而言［17］，現有資料不足以闡明蘭科花粉系統演化的多樣性，亟待補充。相應地，我國蘭科花粉形態學的研究資料很少。早期研究揭示了內蒙古分布的13 屬18 種蘭花的花粉團，表現出明顯的屬間和種間差異［34］，后來集中在部分藥用和觀賞蘭花，如：手參屬（Gymnadenia）［35］，幾種常見栽培蘭花［36］和6 種杓蘭屬植物（Cypripedium）［31～32］。關于石斛屬花粉形態研究，國內外報道不多，包括印度產的18 種石斛［37］和我國傳統藥材鐵皮石斛（D.officinale）［38］。本文選擇了中國產的13 種石斛和1種來自越南的越南石斛（D.vietnamense Aver.）為研究對象，通過解剖鏡和掃描電鏡，觀察它們的花粉團形態和花粉團表面超微結構特征，為石斛屬的物種鑒定和系統演化提供花粉形態證據，也為我國野生石斛資源的保護和利用提供科學依據。

1 材料和方法

14種石斛的花藥材料取自西南林業大學教學科研實習基地——云南豐春坊生物科技有限公司蘭花種質資源保存中心（位于云南省富民縣境內，102°27'26″E，25°20'19″N）。在2018 和2019 年先后陸續采集14 種石斛的開放花材料（見表1），帶回實驗室處理。一部分新鮮花藥在解剖鏡（Leica M165FC）下觀察拍照，記錄花粉團數目、大小和形態。每種石斛至少選取5 朵花分別測量整體花粉團和單個花粉團的極軸最長和赤道軸最寬處的長度。同時，由于花萼和花瓣比較相似，且稍長，故測量每種石斛的花萼，用來判斷花朵大小。這些數據重復測量5 次，統計其最大值和最小值，計算其平均值。另一部分新鮮花藥固定于50%的酒精，24 h 后轉70%的酒精，常溫保存。固定后的花藥在解剖鏡下分離出花粉團，采用酒精梯度脫水，經臨界點干燥，放置在粘有導電膠的樣品臺，利用E-1045 離子濺射裝置噴金鍍膜后，在掃描電子顯微鏡（Zeiss Evo LS10）下分別放大1 000 和 2 000倍觀察花粉團外壁紋飾特征，拍照并記錄。由于花粉團的上半部（背面）的表面紋飾特征較穩定，因此選擇該部位為主要拍照區域。挑選出來的照片，用圖像編輯軟件Photoshop CS 6.0 進行排版。蘭花結構術語參考陳心啟等《中國蘭科植物鑒別手冊》［39］，花粉團超微形態特征描述參考韋仲新《種子植物花粉電鏡圖志》［40］。

2 研究結果

2.1 14種石斛花形態特征及物種鑒定

本文觀察了14 種石斛的花形態特征（見圖版Ⅰ），根據《中國植物志—蘭科19卷》［20］鑒定了物種名稱，確定了14 種石斛分別來自于4 個組（sec?tion）（見表1），即石斛組（sect.Dendrobium）10 種，頂葉組（sect.Chrysotoxae）2 種，瘦軸組（sect.Brevi?flores）和草葉組（sect.Stachyobium）各1 種。同時，14 種石斛里有4 個中國特有種（細葉石斛D.han?cockii、廣東石斛D.wilsonii、矩唇石斛D.linawianum和勐海石斛D.minutiflorum）和1 個外來種（越南石斛），具體如下：

表1 14種石斛材料信息Table 1 Materials for 14 species of Dendrobium

第一，有10 種石斛屬于石斛組［20］。它們花序軸、花序柄粗壯，花大，萼片長1 cm以上，唇瓣不裂或不明顯3 裂，全緣，不整齊，分別是細葉石斛、黃花石斛（D.dixanthum）、廣東石斛、石斛（D.nobile）、大苞鞘石斛（D.wardianum）、杯鞘石斛（D.gratiosis?simum）、矩唇石斛、束花石斛（D.chrysanthum）、細莖石斛（D.moniliforme）和喇叭唇石斛（D.lituiflo?rum）（見圖版Ⅰ：1～10）。就唇瓣而言，除了細葉石斛的唇瓣中下部稍有縊縮外（見圖版Ⅰ：1），其余9種的唇瓣明顯不裂，具有完整的圓形（見圖版Ⅰ：2）或弧形（見圖版Ⅰ：3～10）。這10 種石斛的花萼長達1～4 cm，屬于石斛屬中的大花類。

第二，有2 種石斛來自頂葉組［20］即球花石斛（D.thyrsiflorum）和密花石斛（D.densiflorum）。這2種石斛的莖干粗壯具有明顯的縱棱，總狀花序下垂，但花形區別明顯。球花石斛的花萼和花瓣白色，唇瓣黃色；密花石斛的花萼和花瓣淺黃色，唇瓣深黃色（見圖版Ⅰ：11～12）。

第三，本文研究的越南石斛為越南發現的新種，分布于越南西北部，歸于瘦軸組（sect.Brevi?flores）［41］。越南石斛的花瓣和花萼比較相似，上半部粉色，下半部白色，唇瓣比萼片短，凹陷成淺舟狀（見圖版Ⅰ：13），符合瘦軸組的分類學特征［20］。第四，勐海石斛（D.minutiflorum）只分布在云南，不僅屬于中國特有種，而且還是云南特有種。它的植株矮小，禾草狀，莖干肉質短小，花序直立，花萼僅6～8 mm，花很?。ㄒ妶D版Ⅰ：14），符合草葉組的分類學特征［20］。

2.2 花藥內4個花粉團的形態特征

成熟花藥位于合蕊柱頂部，由一對側生藥室和一個花藥帽組成。移去花藥帽，露出藥室開裂后自然脫落的4 枚花粉團。花粉團表面金黃油亮呈蠟質，質地堅硬。4枚花粉團離生，兩兩成對，緊密排列，構成了4-花粉團形態輪廓。靠外的2枚外花粉團較短，靠內的2 枚內花粉團較長（見圖版Ⅱ）。因此，從正面和背面看，4-花粉團的總體輪廓基本為心形，各有特點。4-花粉團，正面朝外，微拱外凸，構成弧面；背面緊挨藥床，平整垂直，為平面。值得說明的是，本文觀察到的14 種石斛的新鮮花粉團皆為鮮黃色，但有7種石斛觀察拍照的花粉團為酒精固定后的材料，花粉團脫色后呈棕色或褐色，包括細莖石斛、大苞鞘石斛、細葉石斛、黃花石斛、廣東石斛、石斛和密花石斛。為更好地理解石斛花粉團的大小、組成和形態，本文研究了4 個花粉團的整體大小和形態以及單個花粉團形態（見表2），描述如下。

表2 14種石斛花粉團形態及表面紋飾（根據花粉團外壁紋飾特征排列）Table2 Polliniamorphologyandexinesculpturein14speciesofDendrobium（orderaccordingtothetypeofpolliniumexcine）

第一，根據4-花粉團的整體輪廓形態的極軸（P）和赤道軸（E）長度（單位：mm）判斷14 種石斛花粉團的大小。結果表明，極軸和赤道軸長度在種間變異較大，最長和最短相差了5 倍以上，其變化范圍分別為0.49～2.26 和0.51～2.30，平均值分別為1.49 和1.31。其中，極軸和赤道軸最長和最短的花粉團分別出現在大苞鞘石斛（P2.26/E2.30）和勐海石斛（P0.49/E0.51）。14 種石斛里，大苞鞘石斛的花粉團最大，勐海石斛的花粉團最小。

第二，根據花粉團的極軸長度（P，單位：mm），從小到大把14種石斛的4-花粉團分為4種類型：極小花粉團（0.10～1.00）、小花粉團（1.01～1.50）、大花粉團（1.51～2.00）和超大花粉團（2.01～2.50）（見表2）。第1種：極小花粉團，指花粉團極軸長度在0.10～1.00，有3種：勐海石斛（0.49）、細莖石斛（0.72）和廣東石斛（0.93）。第2種：小花粉團，指花粉團長度在1.01～1.50，有4種：黃花石斛（1.47）、越南石斛（1.43）、密花石斛（1.36）和矩唇石斛（1.32）。第3種：大花粉團，指花粉團極軸長度在1.51～2.00，有5種：杯鞘石斛（1.68）、束花石斛（1.71）、喇叭唇石斛（1.73）、細葉石斛（1.81）和石斛（1.90）。第4種：超大花粉團，指花粉團極軸長度在2.01～2.50，有2種：球花石斛（2.05）和大苞鞘石斛（2.26）。

第三，根據花粉團的極軸和赤道軸的長度比值范圍（R=P/E：0.95～1.77），把14 種石斛的花粉團分為3 種形態：心形（heart-shaped）、近心形（nearly heart-shaped）和長心形（long heart-shaped）（見表2和圖版Ⅱ～Ⅳ）。第一類，心形：出現在花粉團極軸和赤道軸的比值為0.95，4 個花粉團正面和背面輪廓，皆呈典型的心形：上寬下細，頂部鈍，底部尖，兩側的外花粉團曲線流暢，具有典型的心形輪廓，僅出現在細莖石斛（見圖版Ⅱ：1～2）。第二類，近心形：指花粉團極軸和赤道軸的比值（R）約等于1.00（0.95～1.10），4 個花粉團排列的輪廓基本呈心形，出現在6 個種：勐海石斛（見圖版Ⅱ：5～6）、大苞鞘石斛（見圖版Ⅱ：9～10）、束花石斛（見圖版Ⅱ：13～14）、細葉石斛（見圖版Ⅱ：17～18）、喇叭唇石斛（見圖版Ⅲ：1～2）和黃花石斛（見圖版Ⅲ：5～6）。第三類，長心形，指花粉團極軸和赤道軸的比值（R）大于1.10，變化范圍為1.14～1.77，位于外側的單花粉團邊界呈弧線，因為比值大于1.1，甚至達1.7，看上去像拉長的心形，出現在7 種石斛。其中，5 種石斛的花粉團外側邊緣皆有一定的弧度，保持著長心形的輪廓，包括石斛組的矩唇石斛（見圖版Ⅲ：9～10）、廣東石斛（見圖版Ⅲ：13～14）和杯鞘石斛（圖版Ⅳ：9～10），頂葉組的球花石斛（見圖版Ⅳ：5～6）和瘦軸組的越南石斛（見圖版Ⅳ：1～2）。另外2 種石斛的花粉團外側邊界的弧度明顯，稍有變化，如石斛組的石斛（1.17），其外側花粉團邊緣呈直線（見圖版Ⅲ：17～18）；頂葉組的密花石斛（1.77）的花粉團兩個外花粉團輪廓，一邊呈弧形，一邊近直線（見圖版Ⅳ：13～14）。

第四，本文觀察了同一花藥內單個花粉團的大小和形態（見表2）。14種石斛同一花藥的4枚單花粉團長短不一、形態不同，成對排列，決定了4-花粉團的形態輪廓特征（見圖版Ⅱ～Ⅳ）。為方便描述，把位于中央的兩枚長而直的花粉團叫做內花粉團（the inner pollinium），靠外的兩枚短且曲的花粉團稱之為外花粉團（the outer pollinium）（見圖版Ⅱ：3～4）。研究發現，由于4個花粉團緊密并排、相互擠壓，中央兩個內花粉團形態相似，皆稍直而窄，兩側壓扁；兩個外花粉團形態也相似，稍彎且寬，內側扁平，外側彎曲。同時，緊挨花藥帽的花粉團上端，盾圓而截平，靠花藥裂口處的花粉團底部，細尖而呈峰谷狀。本文觀察了每種石斛的單個內、外花粉團的輪廓，把它們分為4 類：月牙型、弓型、棍狀、米粒型。第一類：月牙型（crescent-like），單花粉團兩側以不同程度向同一方向彎曲，以外側花粉團居多，如大苞鞘石斛（見圖版Ⅱ：12），束花石斛（見圖版Ⅱ：16），細葉石斛（見圖版Ⅱ：20），黃花石斛（見圖版Ⅲ：8）和密花石斛（見圖版Ⅳ：16）；有的石斛其內外側單花粉團皆為月牙型，如喇叭唇石斛（見圖版Ⅲ：3～4）和矩唇石斛（見圖版Ⅲ：11～12）。第二類：弓型（bowlike），單個花粉團輪廓一邊彎曲，一邊近直，以內側花粉團居多，如大苞鞘石斛（見圖版Ⅱ：11）和束花石斛（見圖版Ⅱ：15）；也有內外側單花粉團皆為弓形，如：廣東石斛（見圖版Ⅲ：15～16），石斛（見圖版Ⅲ：19～20）和杯鞘石斛（見圖版Ⅳ：11～12）。第三類：棍狀（stick-like），單花粉團兩側近直，上下兩端幾乎一樣寬。最典型的如球花石斛內、外花粉團（見圖版Ⅳ：7～8），形似的如勐海石斛的內、外花粉團（見圖版Ⅱ：7～8）。細葉石斛（圖版Ⅱ：19），黃花石斛（見圖版Ⅲ：7）和密花石斛（見圖版Ⅳ：15）內花粉團。第四類：米粒型（rice grain-like），中間圓胖，一端鈍圓，一端尖。最典型的如細莖石斛的內、外花粉團（圖版Ⅱ：3～4），形似的如越南石斛的內、外花粉團（圖版Ⅳ：3～4）。

2.3 花粉團外壁紋飾特征

掃描電鏡下，當放大到1 000 倍時，可觀察到14 種石斛的花粉團表面的單個或2 個以上的四合花粉構成的花粉團亞單元的界限清楚，絲狀或晶體附屬物可見。當放大到2 000 倍時，可看到花粉團亞單元的表面無萌發孔，紋飾差異明顯，光滑平整，光滑不平整或有皺波狀或帶有絲狀附屬物或晶狀體。據此，本文把14 種石斛的花粉團表面紋飾分為5類，具體如下。

第1 類：光滑平整型（Type 1：psilate，見圖版Ⅴ：1～8），指組成花粉團表面紋飾光滑平整，無隆起，出現在4 種：越南石斛（見圖版Ⅴ：1～2），細葉石斛（見圖版Ⅴ：3～4），廣東石斛（見圖版Ⅴ：5～6）和球花石斛（見圖版Ⅴ：7～8）。

第2 類：平滑帶絲狀突起（Type 2：psilate with threads，見圖版Ⅴ：9～14），該類花粉團表面光滑，具不同密度的絲狀物突起，出現在石斛組的3 個種，差異明顯。其中絲狀物短、不發達，只集中在花粉團亞單元中央的是石斛（見圖版Ⅴ：9～10）；絲狀物短、不發達，但遍布花粉團亞單元的是杯鞘石斛（見圖版Ⅴ：13～14）；絲狀物細長、發達，如蛛網密布整個花粉團亞單元表面的出現在大苞鞘石斛（見圖版Ⅴ：11～12）。

第3類：光滑不平整型（Type 3：psilate-uneven，見圖版Ⅴ：15～24），該類型花粉團表面光滑，伴隨著不同程度的凹陷或突起，出現在5 種石斛，各有區別。黃花石斛的光滑表面形成1～2 條淺隆的脊（見圖版Ⅴ：15～16）；矩唇石斛有1～2 條凹槽（見圖版Ⅴ：17～18）；束花石斛為不規則凹槽，伴有穴點，構成了殼狀突起（見圖版Ⅴ：19～20）；細莖石斛有的部分凹陷為穴，有的整個拱起呈飽滿狀，為不規則突起（見圖版Ⅴ：21～22）；密花石斛沿周緣明顯隆起成寬脊，內部凹陷帶穴狀（見圖版Ⅴ：23～24）。

第4 類：粗網紋狀（Type 4：coarse reticulate，見圖版Ⅴ：25～26），指花粉團表面光滑，但沿單個花粉邊界隆起呈長條形脊線，中央凹陷平坦，構成了粗網交織的花粉團表面紋飾，僅出現在石斛組的喇叭唇石斛（見圖版Ⅴ：25～26）。

第5 類：皺波狀（Type 5：rugulate，見圖版Ⅴ：27～28）花粉團表面不光滑，布滿不規則細紋構成的褶皺，為波浪狀，僅出現在草葉組的勐海石斛（見圖版Ⅴ：27～28）。

此外，本文還觀察到2種晶體：大顆粒晶體，體積較大，呈正方體（邊長約3.09 μm，體積約29.50 μm3），數量多而密集，出現在廣東石斛（見圖版Ⅴ：5～6）。小顆粒晶體（直徑約1.30 μm，體積約2.20 μm3），為細顆粒狀，稀疏而分散，出現在球花石斛（見圖版Ⅴ：7～8）。

3 討論

長期以來，石斛屬的物種鑒定和劃分爭議較大，存在著新種發表，舊種合并的分類學修訂［12～16］，為更好地理解石斛屬的花粉團形態特征及其分類學意義，本文采納了《中國植物志》19 卷的蘭科石斛屬分類系統［20］，根據花形態特征確定了14 種石斛的物種名稱。本文所研究的14 種石斛分屬于4 個組（石斛組、頂葉組、瘦軸組和草葉組），除了越南石斛外，其余13種石斛皆產自中國，還包括4個中國特有種。因此，本文結果為進一步闡明中國石斛屬的系統分類學提供了花粉形態證據。

3.1 花粉團大小和形態的分類學意義

花粉團的大小在種間和組間差異明顯。根據花粉團極軸長度的差異值，14 種石斛的花粉團的長度范圍在0.49～2.26 mm，可分為4種類型。該結果與印度18 種石斛的花粉團長度范圍（0.74～2.75）相似［37］，但前者沒有為花粉團大小分類。從本研究結果可以看出，花粉團的大小和花朵大小有一定相關性。最典型的就是草葉組的勐海石斛，株型不到10 cm，花萼長度不及1 cm，花粉團長僅為0.49 mm，屬于極小花粉團。反之，石斛組的大苞鞘石斛，株型可高至1 m 以上，花萼長度可達4～5 cm，花粉團長度為2.26 mm，屬于超大花粉團。不過，極小花粉團也出現在石斛組的細葉石斛和廣東石斛，其花朵較細窄，在14種石斛中屬于偏小型。對于長度在1.0～2.5 mm范圍內其他3類而言，花粉團長度和花型大小沒有顯著的相關性，在石斛組、頂葉組和瘦軸組中均有同一種類型，難以對組的劃分提供依據。這可能是因為這3 個組的花朵相對較大，萼片長度在2～5 cm，所以花粉團長度保持在1.0～2.5 mm。對于花粉團大小的分類學意義，可以選擇具有不同大小花朵的石斛種類系統研究，為屬內組的劃分提供依據。

本文觀察到的14 種石斛花粉均具有4 枚花粉團，由兩長兩短的內外花粉團組成，構成了以心形為主的3 類花粉團形態。為準確判斷單花粉團類型，本文首先界定了內、外花粉團的定義，根據輪廓線條的曲直，把單個花粉團分為4類：月牙型、弓型、棍狀和米粒型。比較分析認為，14種石斛不同類型的4 個花粉團與單個花粉團的形態和組合相關，可作為石斛屬物種鑒定的依據。石斛屬的花粉團形態及其分類學意義在前人的研究里已有初步研究［37］，但花粉團的形態描述值得進一步探討。前人研究結果觀察到印度產的18種石斛花粉團形態多樣，可分為6種類型（心形、紡錘型、人腳印型、三角形、卵圓形和豆子型）［37］。比較發現，這6種花粉團類型，除了心形判斷相對容易外（頂葉組的D.anceps［37］和本研究中的細莖石斛的花粉團都具典型的心形輪廓），其余5 種類型的描述很難為后人的研究提供幫助。這是因為，這5種花粉團類型的描述缺乏數據的定量分析，以形似或比喻來定性描述，具有不確定性。因此，本文沒有采納這5 種花粉團類型的描述，而是在4-花粉團形態輪的基礎上，根據極軸和赤道軸比值的變化，試探性地提出了3 種花粉團形態（心形、近心形和長心形），為理解石斛屬花粉團形態多樣性及其系統演化提供參考。

3.2 花粉團表面紋飾特征的分類學意義

本文觀察到的14種石斛的花粉團表面紋飾有5 類（光滑平整型、光滑帶絲狀附屬、光滑不平整型、粗網紋型和皺波狀），部分物種存在晶狀體，為石斛屬的花粉團微形態特征提供了新資料。光滑平整型、光滑不平整型、皺波狀等紋飾類型在印度產的18 種石斛［37］和鐵皮石斛［38］中均有報道，但光滑帶絲狀、粗網紋型以及晶體存在等特征屬于新資料。

14種石斛的花粉團表面紋飾類型在組內和組間有明顯差異，具有一定的分類學意義。首先，石斛組的10種石斛的紋飾類型最多，除皺波狀外，其余4種類型皆有。其中光滑型比較常見，粗網紋型少見（喇叭唇石斛），還觀察到大顆粒晶體（廣東石斛）。這說明石斛組的花粉團形態多樣，支持其為多系或并系的分子系統學觀點［6］，也表明把黃花石斛和細葉石斛移到寡花組的處理［2］值得進一步研究。其次，本文觀察到細莖石斛、細葉石斛和廣東石斛的花粉團形態和大小在種間差異明顯，紋飾類型不同，不支持把這3 個種歸到細莖石斛復合群（Dendrobium moniliforme complex）［42］。此外，頂葉組的球花石斛和密花石斛的花粉團紋飾類型差異明顯，前者光滑平整具有細顆粒晶體，后者光滑但邊緣具有隆起的寬脊無晶體，因此支持這一對相似種不宜合并為密花石斛［43］。同時，雖然兩者的花粉團大小不同，但形態皆為長心形，所以支持它們為分子系統樹上親緣關系較近的姐妹群。此外，草葉組（勐海石斛）皺波狀紋飾類型在其他組中尚未出現，比較獨特；瘦軸組（越南石斛）為光滑平整型在其他組也常見，因此關于這兩組的花粉團形態特征的分類學意義需要進一步研究。