環狀RNA叉頭框蛋白O3靶向微小RNA-122-5p對結直腸癌細胞惡性生物學行為的影響▲

趙彥煥 張東姣 樊麗偉 汪景坤 李 洵 付曉霞 張 磊 趙玉紅

(中國人民解放軍第八十二集團軍醫院消化內科，河北省保定市 071000，電子郵箱：muf67d@163.com)

結直腸癌是臨床常見的一種惡性腫瘤，目前結直腸癌的治療技術已取得巨大進步，但結直腸癌晚期患者的預后仍較差。局部浸潤與遠處轉移是導致結直腸癌患者死亡率升高的主要原因，因而探究結直腸癌細胞增殖及轉移的分子機制對尋找新的治療靶點具有重要意義[1]。環狀RNA(circular RNA，circRNA)是一類特殊的非編碼RNA分子，是在mRNA剪接過程中上游5′端與下游3′端拼接在一起形成的閉合環狀結構，大部分circRNA具有普遍性、穩定性與保守性等特點。研究表明circRNA可參與結直腸癌的發生及發展過程，其可通過堿基配對的原則與微小RNA(microRNA，miRNA)結合從而調控靶基因的表達，因此其有可能成為結直腸癌的治療靶點[2-4]。環狀RNA叉頭框蛋白O3(circular RNA forkhead box protein O3，circFOXO3)在胃癌組織中高表達，并可促進胃癌細胞增殖及轉移[5]。但circFOXO3與結直腸癌之間關系的相關研究報告尚少。一項生物信息學分析顯示circFOXO3與miRNA-122-5p存在結合位點，研究表明miRNA-122-5p在結直腸癌組織與細胞系中表達下調，上調其表達可抑制結直腸癌的進展[6]。但circFOXO3/miRNA-122-5p分子軸是否參與結直腸癌的發生及發展過程尚未可知。因此，本研究探討circFOXO3是否可通過靶向調控miRNA-122-5p從而影響結直腸癌細胞的惡性生物學行為。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與試劑 選取2018年12月至2020年1月本院收治的38例結直腸癌患者為研究對象。所有患者均經病理診斷證實為結直腸癌，其中男性28例、女性10例，年齡53～70(61.03±6.11)歲。術中切除患者的癌組織及其相應癌旁組織標本后立即置于液氮中保存。人結直腸癌細胞HCT116購自中國科學院上海細胞庫；杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)購自美國Gibco公司(批號：20190203)；胎牛血清(批號：20181118)、Lipofectamine2000(批號：20181215)、TRIzol試劑(批號：20181203)購自美國Thermo Fisher公司；反轉錄試劑盒(批號：20190103)與熒光定量PCR試劑盒(批號：20181225)購自北京天根生化公司；細胞計數檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑購自上海碧云天生物公司(批號：20190208)；Transwell小室(批號：20181212)、Matrigel基質膠(批號：20190211)購自北京索萊寶公司；si-NC、si-circFOXO3、miRNA-NC、miRNA-122-5p模擬物、抗miRNA-122-5p-NC、抗miRNA-122-5p購自廣州銳博生物公司；兔抗人基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2(批號：20190216)、MMP-9抗體(批號：20190218)與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(批號：20181206)購自美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗分組及干預 取對數生長期人結直腸癌細胞HCT116用胰蛋白酶消化后，按照1×104個/孔的密度接種于6孔板，加入DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱內培養，待細胞生長融合度達到80%時，更換無血清的培養基，用Lipofectamine2000試劑(10 μL)進行轉染。實驗分組：si-NC組(轉染終濃度為50 nmol/L的si-NC)、si-circFOXO3組(轉染終濃度為50 nmol/L的si-circFOXO3)、miRNA-NC組(轉染終濃度為50 nmol/L的miRNA-122-5p-NC)、miRNA-122-5p組(轉染終濃度為50 nmol/L的miRNA-122-5p-模擬物)、si-circFOXO3+抗miRNA-NC組(共轉染終濃度為si-circFOXO3與終濃度為50 nmol/L的抗miRNA-122-5p-NC)、si-circFOXO3+抗miRNA-122-5p組(共轉染終濃度為50 nmol/L的si-circFOXO3與終濃度為50 nmol/L的抗miRNA-122-5p)。轉染6 h后更換為含有10%胎牛血清的正常DMEM培養基，置于37℃、5% CO2的培養箱內培養48 h。

1.3 實時定量PCR檢測circFOXO3、miRNA-122-5p的相對表達水平 用TRIzol法分別提取癌旁組織、結直腸癌組織與轉染后HCT116細胞的總RNA，取1 μg RNA反轉錄合成cDNA，運用熒光定量PCR試劑盒分析circFOXO3[以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參]、miRNA-122-5p(以U6內參為內參)的相對表達水平。檢測儀器為StepOnePlus實時熒光定量PCR儀，采用2-ΔΔCt法進行計算。circFOXO3正向引物序列為5′-GTGGGGAACTTCACTGGTGCTAAG-3′，反向引物序列為5′-GGGTTGATGATCCACCAAGAGCTCTT-3′；GAPDH正向引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miRNA-1225-5p正向引物序列為5′-ACAGTGCGGTCTACGCATGCGTTCGGTAGACAGTCGTAG-3′，反向引物序列為5′-GCGACAGCTGCTTACGTAGGATGCGCGCATAGCTTGCAG-3′；U6正向引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，反向引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。實時定量PCR反應體系包括10×PCR 緩釋液2.5 μL、MgSO42.5 μL、dNTPs 2.5 μL、正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件為95℃預變性2 min，95℃變性60 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖 收集轉染后的HCT116細胞，用胰蛋白酶消化后，3 000 r/min離心10 min，收集重懸細胞，按照1×103個/孔的密度接種于96孔板，分別加入CCK-8試劑10 μL和DMEM培養液100 μL，于37℃、5% CO2培養箱內培養2 h，用SpectraMax化學發光型酶聯免疫檢測儀(北京悅昌行科技有限公司)檢測各孔在波長450 nm處的吸光度值。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.5 平板克隆形成實驗 收集轉染后的HCT116細胞，按照1×103個/孔的密度接種于6孔板，于37℃、5% CO2培養箱內培養，每隔2 d更換一次培養液，直至出現細胞集落時終止培養，棄培養液，用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結晶紫染色液染色20 min，蒸餾水沖洗后晾干，觀察細胞克隆形成數量。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 進行遷移實驗時直接將各組HCT116細胞懸液加入Transwell小室上層(密度4×104個/mL，200 μL/孔)，進行侵襲實驗時需要預先在Transwell小室上層鋪Matrigel基質膠稀釋液(3 mg/mL，40 μL/孔)，將Transwell小室置于37℃、5% CO2培養箱內孵育1 h后，在上層加入各組HCT116細胞懸液(密度為6×104個/mL，200 μL/孔)；下層加入600 μL含有10%胎牛血清的DMEM培養液，于37℃、5% CO2培養箱內培養24 h后取出Transwell小室，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，用4%多聚甲醛固定下層細胞20 min，用0.1%結晶紫染液染色10 min，用倒置顯微鏡觀察小室下層細胞數。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測circFOXO3與miRNA-122-5p的靶向關系 通過生物信息學數據庫starBase(https://starbase.sysu.edu.cn/agoClipRNA.php?source=lncRNA&flag=target&clade=mammal&genome=human&assembly=hg19&miRNA=all&clipNum=1&deNum=0&panNum=0&target=DLGAP4)預測circFOXO3的靶基因，將含有circFOXO3與miRNA-122-5p的結合位點序列片段(由美國Promega公司構建)導入pGL3雙熒光素酶報告載體(美國Promega)中構建野生型載體WT-circFOXO3，用基因突變技術對結合位點進行點突變，將含有突變位點的序列片段導入pGL3雙熒光素酶報告載體中構建突變型載體MUT-circFOXO3，用80 ng熒光素酶報告載體(美國Promega)分別與miRNA-122-5p-NC、miRNA-122-5p模擬物利用Lipofectamine 2000轉染試劑共同轉染至對數生長期的HCT116細胞，24 h后用Dual Luciferase Reporter System(美國Promega)檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶報告基因活性值為內參，計算各組細胞熒光素酶活性值(螢火蟲熒光素酶報告基因活性值/海腎熒光素酶報告基因活性值)。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.8 蛋白質印跡法檢測MMP-2、MMP-9蛋白的相對表達水平 用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取1.2轉染后的HCT116細胞總蛋白，用二喹啉甲酸法定量蛋白，取10 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結束后轉移至聚偏氟乙烯膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)一抗與內參GAPDH(1 ∶1 000)，4℃反應24 h，TBST洗滌，加入二抗(1 ∶2 000)，室溫反應1 h，TBST洗膜，電化學發光顯影后采集蛋白圖像，目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值即為目的蛋白相對表達水平。實驗重復3次，每組設置3個復孔。

1.9 統計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；采用Pearson法進行相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 circFOXO3與miRNA-122-5p在結直腸癌中的表達情況及相關性 與癌旁組織比較，結直腸癌組織中circFOXO3的表達水平升高，miRNA-122-5p的表達水平降低(均P<0.05)，見表1。結直腸癌組織中circFOXO3與miRNA-122-5p的表達水平呈負相關(r=-0.719，P<0.001)。

表1 circFOXO3與miRNA-122-5p在結直腸癌和癌旁組織中的相對表達水平(x±s)

2.2 干擾circFOXO3表達對HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達的影響 與si-NC組比較，si-circFOXO3組的miRNA-122-5p表達水平升高，circFOXO3表達水平下調，細胞活力降低，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平下降(均P<0.05)，見圖1、表2。

圖1 干擾circFOXO3表達后HCT116細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況

表2 兩組HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達的比較(x±s)

2.3 circFOXO3與miRNA-122-5p的靶向關系 circFOXO3與miRNA-122-5p存在結合位點，見圖2。轉染miRNA-122-5p模擬物可明顯降低野生型載體WT-circFOXO3的熒光素酶活性(P<0.05)，而對突變型載體MUT-circFOXO3的熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)，見表3。

圖2 starBase數據庫預測顯示circFOXO3與miRNA-122-5p存在結合位點

表3 雙熒光素酶報告基因實驗結果(x±s)

2.4 miRNA-122-5p過表達對HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達的影響 與miRNA-NC組比較，miRNA-122-5p組的細胞miRNA-122-5p表達上調，活力降低，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數均減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低(均P<0.05)，見圖3、表4。

圖3 miRNA-122-5p過表達后HCT116細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況

表4 miRNA-122-5p過表達后HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達的比較(x±s)

2.5 抑制miRNA-122-5p表達聯合干擾circFOXO3表達對HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達的影響 與si-circFOXO3+抗miRNA-NC組比較，si-circFOXO3+抗miRNA-122-5p組的miRNA-122-5p表達水平下調，細胞活力升高，克隆形成數、遷移及侵襲細胞數均增多，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平升高(均P<0.05)，見圖4、表5。

圖4 抑制miRNA-122-5p表達聯合干擾circFOXO3表達后HCT116細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況

表5 抑制miRNA-122-5p表達聯合干擾circFOXO3表達對HCT116細胞生物學行為、相關基因和蛋白表達影響的比較(x±s)

3 討 論

circRNA廣泛存在于生物細胞中，目前已發現多個circRNA的表達異常與結直腸癌有關，主要分為促癌circRNA與抑癌circRNA，可調控結直腸癌細胞生物學行為。例如，hsa-circRNA-102958通過miRNA-585/CDC25B軸促進結直腸癌的發生[7]；circHIPK3通過充當miRNA-7的海綿分子促進結直腸癌的生長和轉移[8]；circRNA-0000392通過miRNA-193a-5p促進結直腸癌的進展[9]；circRNA CBL.11通過充當miRNA-6778-5p的海綿分子抑制結直腸癌細胞增殖[10]。circRNA在結直腸癌發生及轉移過程中的作用機制成為研究熱點。

本研究結果顯示，結直腸癌組織中circFOXO3的表達水平升高，干擾circFOXO3表達可降低結直腸癌細胞活力，且使細胞克隆形成數減少(P<0.05)，提示干擾circFOXO3表達可抑制結直腸癌細胞增殖及克隆形成。MMP與腫瘤細胞轉移能力有關，其中MMP-2、MMP-9在結直腸癌中的水平升高，可通過降解細胞外基質沉積而促進細胞轉移[11-12]。本研究結果顯示，干擾circFOXO3表達后結直腸癌遷移及侵襲細胞數均減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平降低(P<0.05)，提示干擾circFOXO3表達可抑制結直腸癌細胞遷移及侵襲。

本研究結果顯示，結直腸癌組織中miRNA-122-5p的表達水平降低，circFOXO3與miRNA-122-5p的表達水平呈負相關，且干擾circFOXO3表達后可明顯促進結直腸癌細胞中miRNA-122-5p的表達(P<0.05)，提示circFOXO3可能通過負向調控miRNA-122-5p的表達從而參與結直腸癌的發生及發展過程。研究表明，miRNA-122-5p通過下調雙特異性磷酸酶4抑制胃癌細胞遷移和侵襲[13]，并可通過靶向LYN激酶抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲[14]。此外，miRNA-122-5p還可通過靶向特異AT序列結合蛋白1抑制鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲[15]。這些研究表明miRNA-122-5p在腫瘤的生長及轉移過程中可能發揮抑癌基因作用。本研究結果通過雙熒光酶報告基因檢測進一步證實，結直腸癌細胞中circFOXO3與miRNA-122-5p存在結合位點，并可競爭性結合miRNA-122-5p。此外，miRNA-122-5p過表達可降低結直腸癌細胞活力、克隆形成、遷移及侵襲能力，而抑制miRNA-122-5p表達可明顯拮抗干擾circFOXO3表達對結直腸癌細胞惡性生物學行為的作用。提示circFOXO3靶向miRNA-122-5p促進結直腸癌進展。

綜上所述，結直腸癌組織中circFOXO3表達水平升高，而miRNA-122-5p表達水平降低，干擾circFOXO3表達可通過負向調控miRNA-122-5p從而抑制結直腸癌細胞增殖、克隆形成、遷移及侵襲。由此可見circFOXO3可充當miRNA-122-5p的海綿分子而參與結直腸癌發生及發展過程，其或可作為結直腸癌的治療靶點。這為進一步闡釋結直腸癌的發病機制奠定了實驗基礎，下一步實驗將進行體內動物實驗驗證circFOXO3/miRNA-122-5p分子軸在結直腸癌發生過程中的作用機制，進一步探尋miRNA-122-5p的可能作用靶點，以明確circRNA-miRNA-mRNA分子軸在結直腸癌發生及轉移過程中的作用機制。