小干擾RNA技術在逆轉肝纖維化中應用效果的研究進展▲

馮一丹 呂蕊花 史琳娜 張喜榮 閆盎然

(陜西中醫藥大學1 第二臨床醫學院，2 醫學技術學院，咸陽市 712046，電子郵箱：1808827370@qq.com)

【提要】 肝纖維化是多種慢性肝病發展過程中的共同病理改變，發病時肝細胞發生炎癥壞死，肝內纖維結締組織異常增生。目前認為肝纖維化發生的主要機制是肝星狀細胞活化、細胞外基質的合成與降解失衡導致細胞外基質在細胞間隙過度積累所致。小干擾RNA技術通過合成反義小分子RNA從而特異性抑制靶基因的轉錄后表達，在逆轉肝纖維化的過程中應用小干擾RNA技術具有強大的潛力。本文從抑制肝星狀細胞活化和增殖，促進肝星狀細胞衰老、凋亡與死亡，以及直接調節細胞外基質的合成與降解3方面對小干擾RNA技術在逆轉肝纖維化中的應用效果進行綜述。

肝纖維化是多種病因導致的慢性肝臟疾病發展到肝硬化的中間過程，是一個可逆階段[1-3]。但目前還未發現可以有效逆轉肝纖維化的藥物，臨床上主要通過去除原發病因或干預纖維化的進程以達到逆轉肝纖維化的目的[4]。

RNA干擾技術于1998年首次被發現，是指雙鏈RNA在細胞內特異性誘導與之同源的mRNA降解或抑制其翻譯，使相應基因表達關閉，從而誘導基因在轉錄后水平沉默[5]。之后RNA干擾技術迅速成為研究基因功能的工具之一，另外，該技術作為疾病靶向基因治療的新手段，已被用于各種疾病的治療[6]。近年來，有研究發現RNA干擾可以高效、準確地沉默肝纖維化過程中的關鍵基因，阻止其表達，認為RNA干擾對肝纖維化的逆轉有重要作用。本文分別從抑制肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化和增殖，促進HSC的衰老、凋亡與死亡，直接調節細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的合成與降解3方面來對小干擾RNA技術在逆轉肝纖維化中應用的相關研究進行綜述。

1 小干擾RNA技術抑制HSC的活化與增殖

HSC可分為靜止表型和激活表型，正常情況下HSC處于靜止狀態，當肝臟受到外界刺激時HSC被激活，其表型可由靜止型轉變為活化型。活化的HSC最顯著的特征是表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，分泌多種致炎因子和致纖維化因子，并且實質(如肝細胞)和非實質(如巨噬細胞)細胞均可釋放HSC激活因子，使肝肌成纖維樣細胞分泌多種ECM，與此同時，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)合成減少，相應的組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)合成增加，從而導致肝纖維化的發生。研究表明小干擾RNA可通過以下5種途徑抑制HSC的活化與增殖[7]。

1.1 抑制轉化生長因子β1/Smad的表達 轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1被認為是促纖維化炎癥因子中最重要的介導因子，動物實驗及細胞實驗均顯示沉默TGF-β1具有潛在治療肝纖維化的作用[8-9]。王魯文等[10]構建TGF-β1 短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)沉默表達載體，并將其注入肝纖維化小鼠體內，結果顯示小鼠肝內TGF-β1、Smad3和α-SMA的表達下降，Smad7表達升高，抑制HSC的激活信號，細胞內膠原合成減少，有效抑制了肝纖維化的發展。此外，TGF-β1小干擾RNA還能抑制肝組織中血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)-BB、PDGF-βR及肝組織中磷酸化細胞外調節蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulatory protein kinase1/2，p-ERK1/2)的表達，從而起到改善肝纖維化的作用[11]。Fu等[12]將TGF-βRⅡshRNA轉入大鼠活化的HSC中，隨著TGF-βRⅡ和α-SMA水平的下降，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白與透明質酸的表達水平也隨之降低，肝纖維化程度減輕。

Smads蛋白是TGF-β超家族信號在細胞內轉導的一組蛋白，是目前發現的TGF-β受體的唯一底物。Smad通路在調控TGF-β1介導的ECM沉積過程中具有十分重要的作用,沒有Smads復合物的參與，TGF-β無法誘導HSC轉化、合成并分泌膠原及其他ECM[13]。轉染編碼Smad7基因的腺病毒至HSC可抑制TGF-β1的生物學活性，從而抑制HSC的活化并阻止肝纖維化的發生[14]。Liu等[15]采用小干擾RNA Smad7轉染LX-2細胞，發現其可阻斷吡喹酮介導的LX-2細胞活化和TGF-β1介導的Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen,Col1)α1的增加，提示Smad7在吡喹酮抗肝纖維化過程中具有的關鍵作用。除此之外，HSC中內質網應激對肝纖維化進展也具有影響，Koo等[16]研究發現，存在內質網應激的患者或小鼠的肝組織中Smad2表達水平增加，經慢病毒載體將Smad2小干擾RNA轉入肝組織后，內質網應激介導HSC激活的作用減弱，這表明HSC中的內質網應激促進了肝纖維化的發生，且該過程是通過誘導Smad2的過度表達來實現的，而采用小干擾RNA技術干擾Smad2表達可以抑制HSC激活從而緩解肝纖維化。

1.2 抑制高遷移率族蛋白B1的表達 高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是非組蛋白核內結構蛋白，主要由壞死細胞被動釋放以及單核/巨噬細胞受脂多糖等刺激后表達[17]。研究發現，HMGB1不僅在細胞核內發揮作用，而且被釋放到胞外時可作為一種有效的炎癥介質誘發嚴重的炎癥反應[18]。目前研究認為，HMGB1有可能成為抗炎和防止組織損傷的重要靶點[19]。葛文松等[20]將HMGB1小干擾RNA用Lipofectamine包裹轉染至HSC-T6細胞后發現，細胞增殖受到抑制，凋亡加速，Col1、Ⅲ型膠原(typeⅢ collagen,Col3)表達水平也顯著降低。另有研究發現，HMGB1小干擾RNA可顯著抑制肝內膽管細胞癌的遷移及侵襲，并降低MMP-14蛋白的表達，這提示HMGB1小干擾RNA可以抑制肝內膽管細胞癌增殖，減少膠原沉積，具有預防及治療肝纖維化的潛力[21]。此外，Lan等[22]將HMGB1小干擾RNA導入到小鼠肝細胞系AML-12中，發現其可減少AML-12細胞HMGB1的釋放以及炎癥細胞因子的產生，減輕酒精誘導的肝損傷，阻斷其進一步發展為脂肪性肝炎、纖維化、肝硬化甚至肝癌。

1.3 抑制結締組織生長因子、血小板衍生生長因子、血管內皮生長因子的表達 結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在傷口愈合過程中呈過表達，誘導肌成纖維細胞增殖，導致膠原積累，進而加重肝纖維化[23]。Yu等[24]設計PEI-Fe3O4NP將CTGF小干擾RNA轉入HSC后發現，CTGF小干擾RNA可以降低活化HSC中CTGF的表達水平和膠原蛋白的產生。另有學者用CTGFshRNA轉染HSC-T6細胞，發現HSC-T6細胞生長明顯受到抑制，生長繁殖被阻滯于S期，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白的表達量下降，Smad7 mRNA及蛋白的表達水平升高，提示CTGF小干擾RNA在逆轉肝纖維化進程中有重要作用[25]。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)在肝損傷時呈過表達，因此被認為是激活HSC的有效因子，可以顯著促進HSC的增殖[4]。用小干擾RNA沉默PDGF受體β，發現PDGF受體β小干擾RNA能明顯抑制PDGF-BB的促HSC-T6細胞增殖效應，降低CTGF、TIMP-1和Col1 mRNA表達水平[26]。此外，作為血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族一員的胎盤生長因子(placental growth factor，PlGF)也能介導傷口愈合和炎癥反應，在肝纖維化的發展和血管的生成中發揮重要作用。Li等[27]構建PlGF小干擾RNA載體并經尾靜脈注入膽管結扎的小鼠體內，發現沉默PlGF可以降低小鼠肝臟的炎癥和纖維化程度，抑制HSC的激活與巨噬細胞的活化，并大幅降低了肝纖維化中促炎因子和趨化因子的表達水平，減輕肝纖維化程度。

1.4 抑制血管緊張素Ⅱ的表達 血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)通過誘導NADPH氧化酶(NADPH oxidase，NOX)依賴性氧化應激來加重肝纖維化。AngⅡ的七肽片段Ang-(1-7)可降低AngⅡ的水平，從而預防肝纖維化。Zhang等[28]給予AngⅡ 刺激肝細胞之前采用NOX4小干擾RNA預處理細胞，發現AngⅡ誘導的肝細胞上皮-間質轉化被抑制。另有學者研究發現NOX4小干擾RNA可抑制AngⅡ誘導的NLRP3炎癥小體激活和膠原蛋白合成[29]。Alamandine是新發現的腎素-血管緊張素系統的組成成分，有研究發現，其可通過MrgD受體對AngⅡ 發揮負調控作用，研究人員針對MrgD受體設計了MrgD受體小干擾RNA并將其轉入HSC中，發現Alamandine以及MrgD受體激動劑β-alanine都不能抑制AngⅡ的誘導作用，提示Alamandine是通過MrgD受體抑制NOX4介導的活性氧生成來調控HSC自噬，阻斷Ang誘導肝纖維化作用[30]。

1.5 抑制瘦素的表達 瘦素是由ob基因編碼的分泌型蛋白質，主要由貯脂細胞產生。研究表明，活化的HSC中瘦素 mRNA和蛋白質合成均增加。薛秀蘭等[31-32]設計瘦素小干擾RNA并將其轉入HSC中，同時將其轉染后的HSC導入肝纖維化大鼠體內，結果發現瘦素小干擾RNA可以有效地抑制HSC細胞增殖，促進HSC細胞凋亡，顯著抑制Col1和信號轉導與轉錄激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)的表達。此外，還有研究發現，轉染瘦素shRNA的肝纖維化組織中，Col1及Col3的沉積程度均明顯下降，從而減緩了肝纖維化的發展程度[33]。

2 小干擾RNA技術促進HSC的衰老、凋亡與死亡

各種不良刺激可以激活處于靜止狀態的HSC，使其轉化為肝肌成纖維樣細胞，不斷生成ECM，導致肝纖維化。因此，促進HSC的衰老、凋亡與死亡是減輕肝纖維化的有效途徑。

2.1 抑制半乳糖凝集素3的表達 半乳糖凝集素3(galectin 3,Gal-3)存在于多種組織和細胞內,參與細胞黏附、增殖、凋亡、炎癥反應和免疫反應等多種病理生理過程，還參與腎、肺等纖維化形成過程[34]。Henderson等[35]研究發現，沉默Gal-3基因后，肌成纖維細胞活化和Col1的表達被阻斷，肝纖維化程度明顯減輕。有學者構建Gal-3小干擾RNA并將其轉染至大鼠肝星狀細胞系rHSC-99細胞，也發現細胞增殖明顯受抑制，細胞凋亡率增高，細胞死亡率增加了1.7～2.2倍[36-37]。

2.2 抑制B淋巴細胞瘤-2家族的表達 B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因作為一種抗凋亡蛋白基因，可保護細胞免于病毒、氧化劑等刺激而引起的凋亡。研究發現，在人肝纖維化過程中Bcl-2過表達,可導致HSC持續活化，從而使慢性肝病遷延難愈[38]。Tian等[39]采用肝靶向納米顆粒將阿霉素(DOX)和Bcl-2小干擾RNA轉入HepG2細胞內，結果顯示，該干預可以誘導更多的HepG2細胞凋亡。另有學者構建pGPU6-GFP-shRNA并將其轉染至HSC-T6細胞，發現HSC-T6的Bcl-2基因表達抑制率達80%，HSC-T6細胞生長明顯受抑，這表明沉默Bcl-2能有效抑制HSC中Bcl-2的表達及HSC-T6細胞生長,促進HSC-T6細胞凋亡[40]。

2.3 抑制核因子κB家族的表達 核因子κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)參與細胞對外部刺激的反應,由p50和p65組成的異源二聚體是NF-κB家族成員最常見的形式。NF-κB的激活在細胞黏附、生長和分化中起關鍵作用，且活化的NF-κB信號通路通過上調其下游的靶基因如環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)、細胞周期蛋白D1(cyclinD1)、Bcl-2等,抑制細胞凋亡。Cui等[41]采用NF-κBp65小干擾RNA轉染HSC-T6細胞72 h后，再用脂多糖刺激細胞1h，結果發現NF-κBp65小干擾RNA可有效降低HSC-T6細胞中Bcl-2、Col1、α-SMA、TGFβ1、抗凋亡蛋白A1和基質金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)的mRNA表達水平，MMP-2活性增高，促進HSC凋亡。有學者發現，增高半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)活性可明顯促進HSC凋亡，這表明p65小干擾RNA可以特異性地阻斷NF-κB基因表達，促進HSC的凋亡[42]。此外，張彥亮等[43]發現核因子κB激酶抑制劑(inhibitor of nuclear factor kappaB kinase，IKKβ)小干擾RNA可使HSC的凋亡率顯著增加，Caspase3和Bcl-2相關x蛋白表達水平均明顯升高，而NF-κBp65和Bcl-2蛋白的表達水平明顯下降，HSC凋亡增加，肝纖維化被抑制。

另外，NF-κB還可以直接促進HSC的衰老和死亡。賈巖[44]研究發現，莪術醇誘導的程序性壞死信號可以競爭性抑制促細胞生長的NF-κB的mRNA和蛋白表達，進一步抑制骨膜蛋白介導的活化型HSC的遷移、黏附,進而發揮抗肝纖維化作用。有學者發現經尾靜脈將COX2 shRNA慢病毒載體注入肝纖維化大鼠體內后，肝纖維化組織細胞衰老指數明顯增加，α-SMA mRNA、COX-2 mRNA表達水平顯著下調，p53 mRNA表達水平顯著上調，表明COX2 shRNA可促進肝纖維化組織細胞衰老[45]。

3 小干擾RNA技術直接調節ECM的合成與降解

多種病因可導致肝臟炎癥，使ECM沉積導致肝纖維化，而在這個過程中，這些病因可能均通過誘導相似的下游通路導致肝纖維化的發生，因此，調控這個相似的下游通路或許可以阻斷ECM沉積，從而實現抗纖維化治療[46]。研究發現，核苷酸結合寡聚化結構域樣受體家族端酶募集結構域5(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor family caspase recruitment domain containing 5,NLRC5)在肝纖維化中的過表達導致HSC中Col1和α-SMA的表達水平上調，而NLRC5小干擾RNA可降低Col1和α-SMA的表達水平[47]。另有學者發現阻斷NLRC5表達可降低α-SMA、Col1α1 mRNA及蛋白的表達水平，表明NLRC5可以通過干預HSC活化和ECM合成來調節或抑制與肝纖維化相關的關鍵基因[48]。

3.1 調節纖溶酶原激活物抑制劑1/尿激酶型纖溶酶原激活劑的平衡 由尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、纖溶酶、纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1)和MMP構成的反應體系是調節ECM降解的主要途徑，在肝纖維化形成和發展中起重要作用[49]。纖溶酶原激活物/纖溶酶系統位于纖維溶解系統的上游，能夠直接降解基質成分，并通過激活MMP間接抑制ECM的沉積[49]。越來越多的研究表明纖溶酶原激活物/纖溶酶系統在調節ECM降解和沉積之間的平衡中發揮關鍵作用[49-51]。Hu等[49]研究發現，下調PAI-1表達水平后肝纖維化得到明顯改善，原因可能是下調PAI-1表達水平后，MMP-9及MMP-13表達水平上調，TIMP-1的表達水平下調，從而促進ECM降解。還有學者將重組腺病毒質粒pAdshPAI感染HSC-T6細胞后發現，Col1、Col3、α-SMA、TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達水平明顯降低，MMP-9和MMP-13 mRNA表達水平明顯上調，肝細胞增殖加快，凋亡減少，HSC增殖減慢，G0/G1期時相HSC-T6細胞數目明顯增高，S期細胞數百分比明顯降低，提示沉默PAI-1可誘導HSC-T6細胞周期靜止，抑制其增殖，減緩肝纖維化進程[51]。

3.2 調節基質金屬蛋白酶/基質金屬蛋白酶抑制劑的平衡 肝纖維化的特征是ECM過度積累，主要病因是ECM生成的增加和ECM降解的減少。ECM降解減少是由于MMP和TIMP之間的不平衡，MMP幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分，從而調節ECM降解過程。肝損傷后，TIMP-1過表達導致ECM降解減少[4]。Li等[52]研究發現，沉默MMP-2可導致HSC存活率降低，纖維形成標志物減少。TIMP-1在活化的HSC中呈高表達，并通過抑制基質降解和細胞凋亡促進肝纖維化，采用小干擾RNA沉默TIMP-1后可以減少HSC的增殖和纖維形成[52]。另有學者靶向沉默大鼠體內TIMP-1和TIMP-2的表達后發現，其上游細胞因子PDGF及其受體的表達下調，進而導致p-ERK1/2蛋白的表達水平降低，最終抑制HSCs活化增殖、減輕肝纖維化[53]。

4 小干擾RNA技術調控其他作用因子

核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)是調節機體氧化還原反應的重要轉錄因子，能調節多種抗氧化基因的表達，研究發現，Nrf2信號通路通過調控肝臟的氧化損傷在肝纖維化的防治中發揮重要作用[54]。Prestigiacomo等[55]采用小干擾RNA技術敲除HSC細胞的Nrf2后發現，HSC被激活，HSC遷移及增殖增加，α-SMA和ECM表達水平升高。另有學者發現Nrf2小干擾RNA可使TGF-β1誘導的活性氧物質增多，促進PAI-1表達水平及Smad3的磷酸化水平增高，促進肝纖維化，提示Nrf2在肝纖維化形成與發展過程中有重要作用[56]。

自噬可以促進HSC活化，腫瘤相關基因H19參與了自噬的調控,其過表達可促進HSC的活化，而長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)-H19已經被證實是調控肝纖維化發生發展的重要分子[57]。有研究顯示，胰島素樣生長因子結合蛋白相關蛋白1(insulin-like growth factor binding protein-related protein 1，IGFBPrP1)是一種新發現的致肝纖維化因子，將小干擾RNA-H19轉入IGFBPrP1過表達的小鼠的肝星狀細胞株16 h后，IGFBPrP1 mRNA、LC3B mRNA、α-SMA mRNA的表達水平受到抑制，肝纖維化減輕[58]。此外，HSC的活化往往伴隨著脂滴的消失，LncRNA-H19與脂肪酸、膽汁酸和葡萄糖等多種代謝方式有關，將小干擾RNA LncRNA-H19轉入HSC后，HSC的活化被抑制，HSC中的脂滴含量增加，這提示降低LncRNA-H19的水平，可以恢復HSC脂滴含量,抑制HSC活化,改善肝纖維化[57]。

近年來，很多學者應用小干擾RNA技術減輕肝纖維化程度，如設計了人骨形成蛋白9小干擾RNA、生長因子受體結合蛋白2小干擾RNA、上皮細胞黏附分子小干擾RNA、成纖維細胞生長因子受體小干擾RNA、腫瘤壞死因子α誘導蛋白8樣分子2小干擾RNA，在動物實驗中均發現上述小干擾RNA技術具有很好地減輕肝纖維化的效果[59-63]。

5 小 結

肝纖維化是多種病因導致的肝損傷之后的修復代償過程，是疾病進展到肝硬化甚至肝癌的可逆階段。應用小干擾RNA技術沉默肝纖維化過程中的關鍵基因，可以抑制HSC活化及增殖，促進HSC凋亡，減少ECM沉積，從而逆轉肝纖維化。但現階段小干擾RNA技術的應用大多限于細胞與動物實驗，尚未進行臨床試驗，其在臨床上的應用效果如何還有待進一步深入研究。