中藥影響實驗性自身免疫性腦脊髓炎CD4＋T細胞亞群分化的研究進展

劉 楠，李 納，馬曉華，朱 琳，時程程

中藥影響實驗性自身免疫性腦脊髓炎CD4＋T細胞亞群分化的研究進展

劉 楠，李 納，馬曉華，朱 琳，時程程*

鄭州大學第一附屬醫院藥學部，河南 鄭州 450000

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是由CD4＋T細胞介導的中樞神經系統脫髓鞘性疾病，是國際公認研究多發性硬化（multiple sclerosis，MS）的動物模型。CD4＋T細胞作為EAE模型的主要免疫應答細胞，存在多個亞群，可分泌多種細胞因子，參與病情進展。CD4＋T細胞增殖分化及功能紊亂與EAE發病機制密切相關。目前臨床尚無治療MS的有效藥物，多以對癥應用皮質類固醇激素為主，但不良反應嚴重，且易產生藥物依賴。近年來中藥因作用溫和、藥物安全性較高、成本低、耐受性好等優點逐漸走進大眾視野，針對中藥對EAE中CD4＋T細胞亞群分化的影響展開論述，為臨床用藥提供更多理論基礎。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎；多發性硬化； CD4＋T細胞亞群；中藥；雷公藤；苦參素；冬凌草甲素；姜酚；左歸丸；六味地黃丸

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種中樞神經系統慢性自身免疫性疾病，臨床主要表現為運動障礙、感覺和精神異常等[1]。據統計，全球發病人群中女性患者比例明顯高于男性，且以成年人發病為主，隨年齡升高病情加重，最終導致殘疾或癱瘓，對患者身心健康造成嚴重影響[2]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）病理學特征與MS高度相似，故用作研究MS發病機制的理想實驗模型[3]。目前，關于MS的發病機制尚未完全明確，但已有研究證實CD4＋T細胞亞群分化通過調節機體免疫炎癥反應，在EAE疾病進展過程中起重要作用[4]。因此，探討CD4＋T細胞亞群分化在EAE治療中的變化對改善患者預后有重要意義。中藥具有藥性溫和、成本較低，且不良反應少的優勢，易被患者接受。近年來，隨著人們對中醫認識的逐步加深及中藥應用的推廣，多種中藥被用于EAE的治療，本文主要對近年來中藥治療EAE過程中CD4＋T細胞亞群分化進行總結，為臨床中藥治療MS提供依據。

1 MS

1.1 中醫學致病機制

MS發病機制復雜，目前仍未完全闡明。MS屬中醫“類中風風懿”“類中風風痱”等范疇[5]。中醫認為本病病因主要為腎臟先天稟賦不足，而后天外感淫邪、內傷勞倦，繼而致脾胃肝腎虧虛，內生風濕火痰瘀，由此可知，本病為本虛標實之證[6]。現代醫學根據MS的臨床表現將其分為發作期和緩解期，中醫學根據辨證施治的原則，對MS不同時期采用不同治療方法，發作期以邪實為主，應注重祛邪，緩解期可見內虛，應以調和五臟六腑，補腎益髓為主，標本兼治，內外調和共同施治[7]。

1.2 中藥治療作用機制

目前，臨床中尚無針對性藥物治愈MS，基于中醫辨證論治理論，中藥主要以清內毒、消損傷、補機體為原則進行治療。從中醫角度分析MS的發病機制及治療方法，可以為目前臨床治療提供更廣闊的思路。研究者通過EAE模型進行大量中藥實驗研究，結果發現部分中藥治療EAE可能與免疫調節、抑制炎癥反應等有關[8]。一方面，中藥具有增強和抑制機體免疫反應的雙重作用。研究顯示，雷公藤、苦參等中藥在一定劑量下可調節T淋巴細胞介導細胞免疫反應作用從而改善EAE癥狀，但對免疫器官損害作用輕，臨床治療更為安全[9]。另一方面，中藥具有顯著的抑制炎癥反應作用。研究顯示，當歸、麻黃、柴胡[10]等中藥可有效調節細胞黏附分子、炎癥細胞因子的合成和分泌，可通過調節輔助性T淋巴細胞（Th）1/Th2失衡，參與調節MS異常免疫應答，阻止MS炎癥反應，減輕神經損傷。

1.3 MS動物模型—EAE

目前，EAE是研究MS發病機制最為理想的實驗模型。EAE誘導物經歷多次改進，由最初的狂犬疫苗、兔腦混懸液等最終發展為單一致敏原，主要包括髓磷脂堿性蛋白、髓鞘蛋白脂蛋白、髓鞘相關糖蛋白和髓鞘少樹突膠質細胞糖蛋白等[11]。上述單一致敏原具有敏感性高、模型制備成功率高等優點，其中髓鞘少樹突膠質細胞糖蛋白因具有高度免疫原性，廣泛用于復發性EAE的研究[12]。EAE常用動物模型包括SD和Lewis等大鼠品系，SJL/J和DBAI/J等小鼠品系。SD大鼠來源廣、制備簡單，且成功率高、死亡率低，適合研究推廣。Lewis大鼠具有穩定性好、成功率高等優勢，但該品系不易獲得[13]。SJL/J和DBAI/J小鼠品系對致敏原敏感性高，但造模成功率和潛伏期波動較大，在抗原準備時，輔助卡介苗、弗氏佐劑多次重復注射可提高制模成功率，且EAE模型穩定性相應提高[14]，可廣泛推廣。

1.4 EAE與CD4＋T淋巴細胞亞群分化

EAE是由CD4＋T淋巴細胞介導為主的自身免疫病，CD4＋T淋巴細胞中樞浸潤是EAE典型病變特點。研究表明，樹突狀細胞、巨噬細胞、小膠質細胞表面主要組織相容性抗原復合物II可與CD4＋T淋巴細胞受體結合，從而刺激CD4＋T淋巴細胞活化，產生免疫效應分子及細胞因子，參與病情進展[15]。

1.4.1 對Th1/Th2分化的調節 Th1/Th2是CD4＋T細胞分化出的輔助性T淋巴細胞亞群，主要介導EAE病程中Th1和Th2兩種免疫反應類型。Th1細胞主要分泌γ-干擾素、白細胞介素（interleukin，IL）-12和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α/β等細胞因子，是介導EAE的主要免疫調節細胞[16]。Th1細胞分泌的細胞因子可促進T淋巴細胞向Th1分化，同時細胞因子間可相互作用，促進其他細胞因子分泌。Trinchieri等[17]認為IL-12的分泌可以啟動免疫系統對機體自身發起攻擊，誘發EAE。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5和轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）3種細胞因子，可以負向調節免疫應答，從而抑制中樞神經系統免疫反應。因此，Th1與Th2細胞間存在相互轉化和拮抗的作用，兩者間平衡紊亂共同促進EAE的發生和發展。

1.4.2 對Th17分化的調節 Th17是獨立于經典輔助性T淋巴細胞亞群分化的新T淋巴細胞。Th17主要通過分泌細胞因子IL-17，或直接合成IL-6誘導其他促炎因子的形成，參與EAE病情進展[18]。臨床研究顯示，MS患者腦組織中IL-17 mRNA表達明顯增加，并且在中樞神經系統損傷區域中可以分離出Th17細胞，IL-17可能是導致EAE發病的關鍵因子[19]。Komiyama等[20]將缺失IL-17的CD4＋T淋巴細胞作為抗原轉移至小鼠體內，結果發現不能誘導EAE病理模型；此外，將Th17細胞直接作為抗原注入小鼠體內，相比注入Th1細胞后得到EAE模型更加嚴重。Ghoreschi等[21]研究發現TGF-β和IL-6均可介導Th17分化，此外Th1細胞分泌的IL-23對Th17增殖起關鍵作用。另有研究顯示，IL-23可以促進Th17產生IL-17，使用IL-23 p19抗體可以降低IL-17水平，從而緩解EAE病情發展[22]。有報道顯示，TGF-β可以誘導CD4＋T細胞分化成調節性T細胞，IL-6和IL-21介導調節性T細胞轉化成Th17細胞，造成調節性T細胞與Th17細胞失衡，加重免疫系統炎癥反應，導致EAE病情加重[23]。近年來越來越多的研究發現，Th17在EAE中扮演重要角色，隨著研究的深入，Th17的作用機制將會被進一步揭示。

1.4.3 對Th22分化的調節 Th22屬于一種新近發現的輔助性CD4＋T淋巴細胞亞群，主要通過分泌IL-22、IL-13，IL26和TNF-α等炎性因子參與EAE進程[24]。研究結果表明，IL-22在急性EAE模型中顯著增加，據此推測Th22和IL-22在EAE進程中起重要作用[25]。針對EAE模型的基因檢測發現，IL-22受體R1、R2均可介導中樞神經系統免疫反應，且可通過影響IL-22的分泌參與EAE的進展[26]。臨床研究顯示，復發MS患者外周血Th22占比及IL-22均顯著升高[27]。隨著研究的不斷深入，Th22及調節性T細胞亞群在EAE發病機制及過程中的作用逐步顯現，為臨床治療提供更加充分的理論基礎。

1.4.4 對Teff/Treg分化的調節 調節性T淋巴細胞（regulatory T cell，Treg）和效應性T淋巴細胞（effective T cell，Teff）是近年來新發現的除Th1/Th2外的新的T淋巴細胞亞群平衡系統[28]。Treg在EAE進程中的外周免疫耐受中起關鍵調控作用，可抑制Teff引起的過度免疫反應，避免組織損傷。Villegas等[29]研究顯示，Teff與Treg間維持動態平衡是機體外周免疫平衡的關鍵，二者平衡打破可能是導致EAE發病的重要因素。

2 單味中藥及中藥單體治療EAE中CD4＋T淋巴細胞亞群分化

2.1 雷公藤

雷公藤Hook. f.也稱黃滕根，具有活血化瘀、清熱祛濕、解毒消腫等功效。雷公藤多苷、雷公藤內酯醇等是從雷公藤根部提取的主要活性成分[30]，主要來源于衛矛科雷公藤屬植物，化學結構見圖1。近年研究表明，雷公藤多苷可通過調節免疫細胞參與機體炎癥反應[31]。Zhao等[32]研究發現雷公藤多苷可以通過抑制信號轉導與轉錄因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3而抑制Th17分泌IL-17水平，從而抑制機體免疫反應。張霞等[33]發現，雷公藤內酯醇可以抑制EAE小鼠病灶中Th1和Th17細胞浸潤，增加Treg細胞占比調節EAE免疫反應，陳鳴等[34]得出相似結論。周發明等[35]研究表明，雷公藤多苷可通過抑制β淀粉樣前體蛋白、IL-17等炎癥因子，減輕EAE大鼠軸索損傷，進而延緩EAE病變進程。目前臨床中關于雷公藤或其有效成分對機體特異性和非特異性免疫疾病具有較好的調節作用，主要通過調節CD4＋T淋巴細胞亞群分化及細胞因子分泌發揮作用，但作用的基因靶點不明確。雷公藤內的多種中藥活性成分在治療EAE過程中扮演類激素角色，但與臨床中常用的糖皮質激素不同，具有不良反應少、靶點豐富等優勢，為MS的治療提供更多可能。

圖1 雷公藤多苷和雷公藤內酯醇的化學結構

2.2 苦參素

苦參素是從豆科槐屬植物苦豆子L.全草、根及種子中提取的活性生活堿，具有提高白細胞水平、抑制機體變態反應等多種作用，化學結構見圖2。近年來研究發現，苦參素具有調節EAE大鼠機體免疫炎癥反應作用，可有效防治EAE，延遲EAE發病時間，可有效防治EAE，延遲EAE發病時間，可能通過抑制脊髓中JAK/ STAT3信號通路激活，從而減輕炎癥反應有關[36]。郭小彬等[37]觀察苦參素對EAE的防治作用發現，苦參素可通過調控血清中多種炎癥細胞因子IL-4、INF-γ，減輕EAE發病程度及發病癥狀。既往研究顯示，IL-4、INF-γ在調控CD4＋T淋巴細胞亞群分化過程中具有重要的調控作用[38]。由此可推測，苦參素可能通過調控炎癥細胞因子，進一步調節CD4＋T淋巴細胞亞群分化，參與EAE病情進展，但具體調控機制仍需進一步研究證實。

圖2 苦參素的化學結構

2.3 冬凌草甲素

冬凌草甲素是唇形科香茶菜屬多年生草本植物冬凌草(Hemsl.) Hara.全草中分離出的四環二萜類化合物，化學結構見圖3。藥理學研究表明，冬凌草甲素具有顯著抗腫瘤、抗炎等作用，通過生物信息大數據分析，目前已確認包括促分裂原活化蛋白激酶激酶1、腦膠質瘤中轉化生長因子β2、成纖維生長因子受體1等多達105個潛在活性靶點及PI3K/AKT、過氧化物酶體增殖物激活受體等多條信號通路[39]。鄭配國等[40]研究發現，在EAE小鼠發病前給予冬凌草甲素可有效減輕小鼠脊髓病灶炎性細胞浸潤，且能有效抑制脊髓少突膠質細胞反應性T淋巴細胞的增殖和分化，從而減少INF-γ+CD4＋T淋巴細胞及IL-17+CD4＋T淋巴細胞，發揮預防EAE的功能。INF-γ+CD4＋T淋巴細胞及IL-17+CD4＋T淋巴細胞是機體重要的輔助性T淋巴細胞，因此可推測冬凌草甲素可能通過調節T淋巴細胞亞群中Th1/Th2平衡，發揮EAE免疫調控作用。

圖3 冬凌草甲素的化學結構

2.4 姜酚

生姜Roscoe具有散寒發汗、止吐暖胃等功效，姜酚是生姜根莖中的有效活性成分[41]，化學結構見圖4。姜酚除具有抗腫瘤、抗炎、保肝利膽等功效外，還具有抑制中樞神經的功效。張南煬等[42]研究顯示，6-姜酚可有效抑制脊髓少突膠質細胞糖蛋白誘導的緩解型EAE模型小鼠免疫應答反應，可有效抑制T淋巴細胞浸潤病灶及TNF-α、IL-6等細胞因子分泌，從而有效緩解EAE的進展。姜酚可通過調節CD4＋T淋巴細胞亞群分化而保護EAE，但姜酚分離較為困難，且化學性質仍不穩定，在進一步研究中亟需尋找有效方法降低其分離難度、提高化學穩定性，并進一步明確其作用靶點，以提高其在EAE治療中的應用價值。

圖4 姜酚的化學結構

2.5 其他中藥或中藥單體

劉媚等[43]研究表明，人參皂苷Rd具有調節CD4＋T細胞亞群中Tregs與Th17分化作用，通過上調Tregs占比及IL-10水平、下調Th17占比及IL-17水平，而緩解EAE小鼠腰髓病理學變化，其調控機制可能與叉頭型基因/維甲酸相關孤核受體γt/STAT3信號通路的抑制有關。王東等[44]應用白藜蘆醇聯合間充質干細胞治療EAE小鼠發現，與單獨應用間充質干細胞相比，聯合用藥可有效提高Th1型細胞因子INF-γ、TNF-α水平，降低Th2型細胞因子IL-4、IL-10水平，通過調控Th1/Th2平衡抑制EAE脊髓炎癥反應。李世舉等[45]研究顯示，白芍總苷可通過下調IL-23、IL-17水平，抑制CD4＋T淋巴細胞向Th17細胞分化，減輕EAE病情。上述研究均證實，中藥或中藥單體可通過調節CD4＋T淋巴細胞亞群分化，從而調節EAE免疫炎癥反應，對緩解病情進展起重要調節作用。

3 中藥復方治療EAE中CD4＋T淋巴細胞亞群分化

3.1 左歸丸和右歸丸

溫陽補腎方以左歸丸（補腎）和右歸丸（溫陽）為代表。左歸丸方由熟地、山藥、山茱萸、枸杞子等8味中藥組成，是在六味地黃丸基礎上化裁而成，主要用于遺精盜汗、腰膝酸軟等腎陰不足、精血虧虛者。右歸丸由熟地、山茱萸、山藥、當歸、肉桂等10味中藥組成，主要用于神疲乏力、畏寒肢冷、陽痿等腎陽虧虛者。中醫學認為，EAE發病機制與肝腎有關，在EAE病理過程中使用左歸丸和右歸丸可以顯示良好療效。周莉等[46]研究顯示，左歸丸可在EAE急性期（免疫誘導前15 d）下調Th1細胞因子，抑制免疫炎癥反應，但緩解期可以促進Th1免疫應答反應，促進機體恢復；左歸丸和右歸丸在EAE不同時期均可通過不同途徑糾正Th1/Th2平衡，促進疾病的恢復。樊永平等[47]研究發現，左歸丸和右歸丸可有效降低EAE大鼠腦和脊髓組織中CD4＋T淋巴細胞水平，通過降低CD4＋/CD8+比值發揮治療EAE的作用，由此可知左歸丸和右歸丸對CD4＋T淋巴細胞增殖、分化具有調控作用。滋陰補陽是中醫追求陰陽調和的關鍵，通過左歸丸和右歸丸通過補腎溫陽調節機體陰陽平衡，從而在研究EAE疾病進展和治病機理中起重要作用。

3.2 六味地黃丸和金匱腎氣丸

六味地黃丸為經典補腎方，方含熟地、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮和茯苓6味中藥，臨床治病譜廣，主要為慢性病引起的肝腎不足、腎陰虧虛之證。金匱腎氣丸是在其基礎上加味附子、肉桂制成，主要用于治療腎氣虛弱引起的虛勞、痰飲、消渴等病證，近年來隨著中醫臨床廣泛研究，臨床適用范圍進一步擴大，設計內分泌、免疫、泌尿等多個系統疾病。裘輝等[48]對MS緩解期治療經驗進行總結，根據中醫臨床辨證發現，六味地黃丸治療腎陰虧型MS效果滿意，而金匱腎氣丸治療腎陽不足型MS療效滿意，辨證施治副作用少。劉妍等[49]研究發現，六味地黃丸和金匱腎氣丸對EAE大鼠Th1、Th17及Treg細胞紊亂均有調節作用，通過調控T淋巴細胞分泌的細胞因子TNF-α、TGF-β和IL-17水平改善EAE病情，且調控作用優于醋酸潑尼松龍。MS患者隨著年齡的增長腎氣漸虛，林吉祥[50]研究發現，金匱腎氣丸對老年人群腎氣虛患者具有良好療效，且能提高臨床療效。六味地黃丸和金匱腎氣丸可通過調節機體CD4＋T淋巴細胞亞群分化，從而改調節機體免疫炎癥反應，最終改善EAE癥狀。

3.3 益腎達絡飲和補腎固髓方

益腎達絡飲方由熟地、鹿角膠、石菖蒲、梔子和生甘草等中藥組成，補腎固髓方由淫羊藿、肉蓯蓉、仙茅、圣地、制首烏、郁金和丹參組成，2種復方均是根據MS毒損脈絡、戕害腦髓的病機制定而成。吳彥青等[51]研究表明，益腎達絡飲可有效改善EAE小鼠神經功能損傷，其調控機制為通過干預CD4＋T淋巴細胞水平，從而改善EAE中樞神經系統免疫炎癥反應。補腎固髓方注重調節MS患者肝腎陰虛、痰瘀阻絡的發病機制進行治療，師一民等[52]研究證實，補腎固髓方及其拆方均具有減輕EAE大鼠炎癥細胞浸潤及軸突損傷的作用，且尤以補腎固髓方減輕作用最為顯著，其作用機制可能與下調腦脊髓中微管相關蛋白p-Tau，上調β-tubulin蛋白有關。樊永平等[53]研究顯示，補腎益髓膠囊可通過抑制視神經脊髓炎緩解期患者血清IL-6表達水平。既往研究表明，IL-6可負調控Th1細胞分化，參與EAE進展，由此可以推測補腎益髓方可能是通過調節EAE緩解期Th2向Th1分化而抑制中樞神經炎癥反應的。益腎達絡飲和補腎固髓方中均含有多味益腎填髓中藥，該類藥物含有豐富類激素，治療EAE的機制可能與調節CD4＋T淋巴細胞亞群分化失衡有關。

3.4 二黃方

二黃方主要由生地、熟地、制首烏、水蛭、浙貝母等中藥組成，針對MS腎陰虧虛、痰阻脈絡之病機進行治療，全方滋陰補腎、活血通絡，清熱化痰，改善MS癥狀。具有補腎填精、活血化瘀的功效。研究發現，二黃方可提高EAE大鼠血清IL-4水平，通過調整CD4＋T細胞亞群Th1/Th2平衡達到改善EAE中樞神經功能損傷的作用[54]。目前多項研究均證實Th1/Th2偏移導致參與免疫應答的細胞因子失衡，加重EAE疾病發展，二黃方可能通過糾正這種偏移減輕過度免疫應答，從而達到治療效果。

單味中藥、中藥單體和中藥復方參與T淋巴細胞亞群分化情況見表1。

4 結語

MS病情易反復，發病機制復雜，尚無有效藥物可以根治，臨床所有治療方法僅可以緩解病情，無法徹底治愈。類固醇激素、干擾素、免疫抑制劑等是目前治療MS的主要手段，但存在不良反應大、藥物依賴、適用范圍受限、費用昂貴等缺點[55]。近年來隨著中藥治療EAE研究的不斷深入，發現中藥在調節機體免疫炎癥反應、減輕激素藥物不良反應方面具有較大優勢。中藥治療EAE過程中，可通過調節機體CD4＋T淋巴細胞亞群分化，改變CD4＋T淋巴細胞亞群分泌的炎性因子水平，抑制機體異常免疫炎癥反應，從而改善EAE癥狀。但目前關于中藥調節EAE CD4＋T淋巴細胞亞群分化的研究仍存在一些問題，如EAE實驗動物的多樣性對所得結論的可靠性是否有影響，中藥對CD4＋T淋巴細胞亞群分化影響的同時是否能夠影響其他類型淋巴細胞分化，對體液免疫是否也有影響等，此外，對EAE腦脊液、體液中CD4＋T淋巴細胞亞群及其細胞因子的檢測手段仍不統一，可能對結果可靠性產生影響。因此，今后應選擇合適實驗動物，應用成熟穩定檢測手段，對中藥影響CD4＋T淋巴細胞亞群分化進行更為科學，可靠的分析，為臨床應用中藥防治MS提供實驗依據。

表1 單味藥和中藥復方參與T淋巴細胞亞群分化情況

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on effect of traditional Chinese medicine on differentiation of CD4＋T cell subsets in experimental autoimmune encephalomyelitis

LIU Nan, LI Na, MA Xiao-hua, ZHU Lin, SHI Cheng-cheng

Ddepartment of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a demyelinating disease of the central nervous system mediated by CD4＋T cells. It is an internationally recognized animal model of multiple sclerosis (MS). As the main immune response cell of EAE model, CD4＋T cells have many subsets, secrete many kinds of cytokines, and involve in disease progression. CD4＋T cell proliferation and differentiation and dysfunction are closely related to the pathogenesis of EAE. At present, there is no effective drug for MS in clinic, and most of the drugs are symptomatic application of corticosteroids, however, they have serious side effects and are prone to drug dependence. In recent years, Chinese medicine has gradually entered the public’s field of vision because of its mild action, high drug safety, low cost, and good tolerance. The effects of traditional Chinese medicine on differentiation of CD4＋T cell subsets in EAE are analyzed in this article, in order to provide more theoretical basis for clinical use.

experimental autoimmune encephalomyelitis; multiple sclerosis; CD4＋T cell subsets; traditional Chinese medicine;Hook. f.; oxymatrine; oridonin; gingerol; Zuogui Pills; Liuwei Dihuang Pills

R285

A

0253 - 2670(2021)04 - 1177 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.032

2020-02-20

國家自然科學基金面上項目（31570357）；河南省高等學校重點科研項目計劃（17A310011）

劉 楠，女，碩士，主管藥師，研究方向為免疫藥理。Tel: (0371)66913047 E-mail: l.n_snow@163.com

時程程，女，博士，主管藥師，研究方向為免疫藥理。Tel: (0371)66913047 E-mail: 530693421@qq.com

[責任編輯 崔艷麗]