基于傳統煎藥工藝的黃芪藥材HPLC指紋圖譜及化學計量學質量評價研究

張 倩，楊懷瑾，周 悅，余亦婷，莊欣雅，毛春芹，謝 輝，李 林，陸兔林，嚴國俊*

基于傳統煎藥工藝的黃芪藥材HPLC指紋圖譜及化學計量學質量評價研究

張 倩1，楊懷瑾2，周 悅1，余亦婷1，莊欣雅1，毛春芹1，謝 輝1，李 林1，陸兔林1，嚴國俊1*

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 南京市莫愁中等專業學校，江蘇 南京 210017

基于傳統煎藥工藝建立不同產地黃芪的HPLC指紋圖譜，用于黃芪藥材質量的評價。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）對15批不同產地的黃芪藥材的HPLC指紋圖譜進行相似度評價，并使用SPSS22.0軟件進行聚類分析和主成分分析。選取了12個色譜峰作為指紋圖譜共有峰，15批樣品的相似度計算結果均大于0.990，說明各產地黃芪藥材具有較好的一致性；通過聚類分析可將15批樣品聚為4類；主成分分析采用3個主成分對黃芪藥材進行綜合評價，綜合得分結果顯示，甘肅民樂縣所產批號為HQ-18001（S1）、HQ-18002（S2）和甘肅岷縣所產批號為HQ-18007（S7）、HQ-18006（S6）的黃芪藥材在所有樣品中的綜合得分位于前4名。建立基于傳統煎藥工藝的黃芪藥材質量評價方法操作簡單，重復性好，結果可靠，可以用于黃芪藥材的質量控制和評價。

黃芪；HPLC；指紋圖譜；質量評價；化學計量學

黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。作為常用傳統中藥之一，黃芪味甘、性平，具有補氣固表、利尿托毒、排膿、斂瘡生肌等功效。現代化學研究發現，黃芪中含有皂苷、黃酮、多糖以及氨基酸、亞油酸、生物堿、膽堿等多種化學成分[2-4]，其中黃芪多糖、皂苷、黃酮[5]等化合物具有較強的生物活性。現代藥理研究表明黃芪具有增強免疫力、抗疲勞、降糖、抗病毒、調脂、改善神經內分泌因子分泌、利尿、強心、降壓等多種作用[6]，臨床主要用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、血虛萎黃、內熱消渴等病的治療[7]。

目前國內外報道的關于黃芪藥材指紋圖譜研究的文獻較多[8-13]，但是指紋圖譜研究所用的樣品處理方法是采用有機溶劑提取，對基于傳統煎藥工藝提取所制的黃芪樣品指紋圖譜的研究尚屬空白。本實驗將沿用傳統煎藥工藝，以水為溶劑提取黃芪樣品，結合高效液相色譜-蒸發光散射法（HPLC-ELSD）建立黃芪藥材的指紋圖譜，并運用化學模式識別技術如聚類分析和主成分分析[9,14]，對黃芪指紋圖譜進行模式識別，對不同來源的黃芪藥材進行有效直觀地鑒別和質量評價，深度挖掘黃芪水提取物指紋圖譜所蘊含的藥效成分信息，合理評價黃芪藥材指紋圖譜的整體特征，為采用傳統煎藥工藝制備的制劑，如經典名方制劑的質量評價提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，包括四元泵、柱溫箱、自動進樣器和Empower工作站（美國Waters公司）；ELSD 2000ES型蒸發光散射檢測器；XWK-III型空氣發生器（天津市津分分析儀器制造有限公司）；MS-105D型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52A型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；X-30R型高速冷凍離心機（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.2 材料

黃芪甲苷（批號110781-201717）和毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606）均購自中國食品藥品檢定研究院；黃芪皂苷I（批號H-038-181121）和黃芪皂苷II（批號H-037-171121）均購自成都瑞芬思生物有限公司；黃芪皂苷III（批號180419）購自南京森貝伽生物科技有限公司；毛蕊異黃酮（批號20120111）購自上海源葉生物科技有限公司；芒柄花苷（批號JBZ-0778）購自南京金益柏生物科技有限公司；刺芒柄花素（批號P1415345）購自上海泰坦科技股份有限公司。所有對照品質量分數均大于98%。冰乙酸（批號D1918059，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；實驗用水為雙蒸水；其他試劑均為分析純。

本研究收集了甘肅省民樂縣、岷縣及渭源縣3個產地的黃芪藥材，共15批，見表1。經筆者鑒定為蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var.(Bge.) Hsiao或膜莢黃芪(Fisch.) Bge.的干燥根，具體見表1。

表1 黃芪藥材信息

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花苷、刺芒柄花素、黃芪皂苷I、黃芪皂苷II、黃芪皂苷III對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解定容，制得質量濃度分別為1.024、1.960、1.019、1.034、1.241、1.068、0.999 0、1.058 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取黃芪藥材粉末（過10號篩）約30 g，精密稱定，加8倍量水浸泡30 min，加熱回流60 min，趁熱200目濾布濾過；藥渣再加8倍量水，加熱回流60 min，趁熱濾過，合并2次濾液，待濾液冷卻至室溫后8000 r/min低溫25 ℃離心10 min，全部上清液濃縮至30 mL，濃縮液加甲醇120 mL，混勻后靜置30 min，離心（參數同上），上清液濃縮至10 mL，濃縮液加甲醇40 mL，混勻后靜置30 min，離心（參數同上），上清液減壓回收溶劑，殘渣精密加入80%甲醇5 mL，超聲使溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Hedera ODS-2柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：乙腈（A）-0.2%的冰乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～16 min，15%～23% A；16～20 min，23%～28% A；20～25 min，28%～30% A；25～30 min，30% A；30～35 min，30%～32% A；35～45 min，32% A；45～50 min，32%～40% A；50～55 min，40%～45% A；55～60 min，45%～65% A；60～65 min，65%～95% A）；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；載氣體積流量2.7 L/min；漂移管溫度102 ℃。

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品（S1）各20 μL，按“2.1.3”項下色譜條件，連續進樣6次測定，記錄譜圖。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，考察共有峰相似度的一致性。結果顯示，各特征共有峰相對保留時間RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于5%，表明所用儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 取同一批號（S1）的黃芪藥材粉末6份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定，記錄色譜峰。以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于5%。

2.2.3 穩定性試驗 將供試品溶液室溫保存，分別于0、2、4、6、8、12、20、24 h測定HPLC色譜圖，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于5%。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 黃芪藥材HPLC指紋圖譜的測定 分別取15批來源不同的黃芪藥材30 g，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜峰（圖1）。

將15批黃芪藥材的HPLC色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”2004A版進行色譜峰匹配，對獲得的的指紋圖譜進行處理后共標定并指認12個共有峰，經過與對照品溶液色譜圖比對后，確認樣品圖譜中1號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，6號峰為黃芪黃芪皂苷Ⅱ，9號峰為黃芪皂苷Ⅲ，見圖2。

圖1 15批黃芪藥材的HPLC指紋圖譜

1-毛蕊異黃酮葡萄糖苷 6-黃芪皂苷Ⅱ 9-黃芪皂苷Ⅲ

2.3.2 相似度評價 將15批黃芪藥材樣品指紋圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A），利用中位數法，以S1號樣品色譜圖為參照譜圖，采用多點校正后進行自動匹配，生成對照譜圖，以此作為黃芪藥材的對照指紋圖譜，進行相似度評價，S1～S15的相似度分別為0.996、0.995、0.999、0.998、0.999、0.996、0.999、0.999、0.991、0.999、0.993、0.998、0.998、0.997、0.998。15批黃芪藥材的相似度計算結果均大于0.99，說明各產地的藥材具有較好的一致性，可以用于綜合評價黃芪藥材的整體質量。

2.4 聚類分析

將不同產地的黃芪藥材HPLC指紋圖譜的12個共有峰的峰面積為特征，得到15×12階原始數據矩陣，運用SPSS22.0分析軟件對其進行聚類分析，采用組間連接法，以歐氏平方距離為測度，Z標準化，對樣品進行聚類分析，結果見圖3。15個黃芪藥材樣品總共可以聚為4類，批號為S1、S2、S3、S4聚為第1類；批號為S7、S10、S5、S13、S15、S11、S12、S8聚為第2類；批號為S6、S9為第3類，批號為S14單獨成一類為第4類。從聚類分析的結果來看，黃芪藥材的指紋圖譜與其地理位置、外界環境具有一定的相關性，但不絕對相關。

圖3 15批黃芪藥材指紋圖譜的聚類分析樹狀圖

2.5 主成分分析

主成分分析是最常用的多指標線性降維壓縮和多變量分析方法。它可將原有眾多具有一定相關性的變量，重新組合成一組新的、相互無關的綜合指標來代替原有的變量，從而實現以最少的主成分盡可能多的體現原變量的信息，以揭示數據結構特征，提取化學信息，已廣泛應用于中藥材的品質綜合評價與分類。

采用SPSS22.0統計軟件對15批的黃芪藥材的指紋圖譜數據進行主成分分析，將15批樣品12個共有峰峰面積導入SPSS22.0軟件，進行主成分分析。對于黃芪藥材共有峰峰面積Z標準化處理后，計算相關系數矩陣，主成分特征值、累積貢獻率及主成分綜合得分等。

2.5.1 相關性分析 相關系數矩陣見表2。1號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，6號峰為黃芪皂苷II、9號峰為黃芪皂苷III。峰1（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）與色譜峰3具有較大的正相關性；峰2、4、5具有較大的正相關性；峰6和峰7具有較大的正相關性；峰9（黃芪皂苷III）、峰10、11和色譜峰12相互之間均有較大的正相關性。

2.5.2 特征值、方差貢獻率 相關系數的特征值和方差貢獻率見表3和圖4。以特征值＞1為提取標準，得到前3個主成分的累積方差貢獻率為90.268%＞85%，故選取前3個主成分即可進行評價，它代表了黃芪藥材中12個成分量的90.268%的信息量，具有很好的代表性，足以評價黃芪藥材的品質。

表2 相關系數矩陣

表3 特征值和方差貢獻率

圖4 公共因子碎石圖

根據因子荷載矩陣，推測影響黃芪藥材質量差異的并不是單一成分，而是多成分的協同作用的結果。從表4和圖5中可以看出，第1主成分的信息主要來自于色譜峰5、6、7、9、10、11、12；第2主成分的信息主要來自色譜峰1、2、3、4；第3主成分主要來自色譜峰8的信息。

2.5.3 不同產地黃芪藥材的綜合評價 用3個主成分對黃芪藥材進行綜合評價，將得到的特征向量與標準化后的數據相乘，得到主成分表達式，再以每個主成分所對應的特征值占提取主成分的特征值之和的比例作為權重得到了主成分綜合模型，根據主成分綜合模型計算15批黃芪藥材的主成分得分及綜合得分值，見表5。綜合得分越高，表明質量越好。綜合得分顯示，甘肅民樂縣所產S1、S2和甘肅岷縣所產S7、S6的黃芪藥材在所有樣品中的綜合得分位于前4名，表明該4個批號的黃芪藥材質量較好，對應藥材指紋圖譜信息，該4個批號的黃芪藥材的指紋圖譜中主要成分1、2、3、4、5、6、7、8的峰面積值均較大，結果也證明了主成分分析時提取的3個主成分能夠基本體現指紋圖譜的所有信息。綜合聚類分析結果分析，第2類黃芪藥材質量較差，其余批號的黃芪藥材質量較好，且甘肅省民樂縣所產S1的黃芪藥材質量最好。主成分綜合分析結果與聚類分析的結果相互得以印證。15個不同產地的黃芪藥材的質量的差異，分析原因可能是不同的生態環境（包括土壤、氣候、水分、礦物質分布情況等）對中藥材的質量產生一定的影響。自然生態環境與中藥資源的質量（有效成分的形成和積累）、數量密切相關，是其生態適宜性評價的客觀基礎，也是藥材生產區劃分的關鍵所在。不同批號的黃芪藥材再按綜合主成分得分值進行聚類分析，聚類結果見圖6。15批黃芪藥材分為3類，綜合得分排名第1、2名的甘肅民樂縣所產S1和S2的黃芪聚為第1類；S8、S9、S11的黃芪藥材聚為第2類；其他批號的黃芪藥材具為第3類，其中S7和S6批號的黃芪綜合得分排名第3、4名，與上述聚類分析結果基本一致，略有不同。

表4 初始因子荷載矩陣

圖5 樣本在3個主成分的平面分布圖

表5 主成分得分、綜合得分排序

圖6 15批黃芪藥材指紋圖譜主成分聚類圖

3 討論

本實驗采用HPLC-ELSD法對黃芪藥材指紋圖譜的色譜條件進行深入摸索，獲得的HPLC圖譜重現性及精密度、穩定性均較好，有利于指紋圖譜的進一步分析。

在流動相系統的選擇中，分別以乙腈-水、乙腈-甲酸、乙腈-磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-0.2%冰乙酸等不同體積分數、不同比例的流動相系統進行梯度洗脫實驗。結果表明，乙腈-0.2%冰乙酸進行梯度洗脫為最佳，基線相對平穩，各主要峰之間能夠基本實現基線分離，且峰形良好，在調整好流動相的不同時間洗脫比例之后，各峰的保留時間適中，重復性和精密度較好，有助于指紋圖譜的分析。

本實驗分別考察了柱溫在25、30、35 ℃時對色譜峰的分離影響。結果表明，隨著柱溫的升高，各色譜峰的保留時間稍有遷移；當柱溫為25、30 ℃時，部分保留時間段內的色譜峰出峰比較接近，未能完全分離；當柱溫為30 ℃時，各色譜峰的分離效果比柱溫在25、30 ℃較好，且整體保留時間較為適中。綜合考慮，故最終選擇30 ℃作為黃芪藥材HPLC指紋圖譜的檢測溫度。

本實驗對黃芪藥材的指紋圖譜進行了相似度評價、聚類分析及主成分分析。根據15個不同產地的黃芪藥材指紋圖譜的分析結果可以看出，15批藥材的相似度計算結果均大于0.990，說明各產地的藥材有較好的一致性。聚類分析將15批黃芪藥材的指紋圖譜聚為4類，聚類結果表明黃芪藥材的指紋圖譜與其地理位置、外界環境具有一定的相關性，但是不絕對相關。用提取的3個主成分對黃芪藥材進行綜合評價，綜合得分結果顯示，甘肅民樂縣所產批號為S1、S2和甘肅岷縣所產批號為S6、S7的黃芪藥材在所有樣品中的綜合得分位于前4名；綜合聚類分析，第2類黃芪藥材的質量較差，其余批號的黃芪藥材質量較好，且甘肅省民樂縣產S1的黃芪藥材質量最好。

本實驗運用指紋圖譜結合化學計量學對不同產地的黃芪藥材質量進行評價，并采用傳統煎藥工藝進行黃芪藥材樣品的處理，較單一的含量測定更為全面準確，對綜合評價和控制黃芪藥材質量具有一定的參考意義，尤其是對以黃芪為原料采用傳統水煎煮工藝制備的制劑質量評價具有很好的指導意義。

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Fingerprints and quality evaluation ofby HPLC coupled with chemometrics based on traditional decoction process

ZHANG Qian1, YANG Huai-jin2, ZHOU Yue1, YU Yi-ting1, ZHUANG Xin-ya1, Mao Chun-qin1, XIE Hui1, LI Lin1, LU Tu-ling1, YAN Guo-jun1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Nan jing MoChou Vocational School, Nanjing 210017, China

To establish a HPLC fingerprints evaluation method for the quality evaluation ofbased on traditional decoction process taking water as solvent.The fingerprints of 15 batches ofwere further evaluated by chemometrics methods. The similarity analyzed with “Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Chinese Materia Medica 2004A”, and hierarchical clustering analysis (HCA) and principal component analysis (PCA) were performed by SPSS 22.0.There were 12 common peaks, and the similarity degrees of 15 batches of samples were more than 0.990, which showed that all the samples from different origins were of good consistency. The samples were divided into four clusters by HCA. The result of PCA showed that the three factors were chosen, the quality of samples could be evaluated basically. According to the composite score, the quality of the batches of HQ-18001 (S1) and HQ-18002 (S2) ofproduced in Minle County of Gansu Province and the batches of HQ-18007 (S7) and HQ-18006 (S6) produced in Minle County of Gansu Province, were the top four in all the samples.The method is simple, reproducible, and reliable, which can be used for quality control and evaluation offrom different origins.

; HPLC; fingerprint; quality evaluation; chemical metrology

R286.2

A

0253 - 2670(2021)04 - 1128 -08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.026

2020-04-06

國家重點研發計劃資助（2019YFC1710603）；國家自然科學基金項目（81773910，82074004）；江蘇高校“青藍工程”項目（2020）

張 倩（1995—），女，碩士研究生,研究方向為中藥藥劑學。Tel: 18260027862 E-mail: 1422943829@qq.com

嚴國俊，教授，主要從事中藥新型劑型及質量評價方法研究。E-mail: yanguojun@njucm.edu.cn

[責任編輯 時圣明]