痹祺膠囊治療膠原誘導型關節炎大鼠的作用機制研究

張冬梅，李寶麗

痹祺膠囊治療膠原誘導型關節炎大鼠的作用機制研究

張冬梅1，李寶麗2*

1. 天津市中醫藥研究院附屬醫院糖尿病科，天津 300131 2. 天津醫科大學總醫院 中醫科，天津 300052

探究痹祺膠囊對膠原誘導型關節炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠中軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）表達的影響。隨機選取10只SD大鼠作為對照組，其余大鼠建立CIA模型，CIA大鼠隨機分為模型組，痹祺膠囊中、高劑量（0.6、0.9 g/kg）組，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg）組，連續給藥4周，觀察大鼠的一般情況和足腫脹變化，檢測大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達、軟骨中COMP mRNA表達。與對照組比較，模型組大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達、軟骨中COMP mRNA表達均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達、軟骨中COMP mRNA表達均顯著降低（＜0.001）。痹祺膠囊可能通過下調COMP表達，抑制炎性細胞浸潤、滑膜增生和關節軟骨破壞，從而治療類風濕關節炎。

痹祺膠囊；類風濕關節炎；軟骨寡聚基質蛋白；膠原誘導型關節炎；滑膜

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性關節疾病，其病理特征為炎性細胞浸潤、關節滑膜增生，伴隨關節軟骨及軟骨下骨進行性損傷，最終導致關節功能障礙，甚至出現畸形，因此RA的早期診斷治療至關重要[1-3]。膠原誘導型關節炎（collagen induced arthritis，CIA）動物模型的臨床癥狀和病理表現與RA極為相似，為研究RA常用的動物模型。軟骨寡聚基質蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）是一種細胞外基質蛋白，主要位于肌腱、軟骨和軟骨周組織。研究表明，COMP既能用于RA的早期診斷，又能用于判斷關節損傷情況[4]。本研究旨在探討痹祺膠囊對CIA大鼠血清中COMP水平、滑膜中COMP蛋白表達和軟骨中COMP mRNA表達的影響，為痹祺膠囊治療RA的作用機制提供依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠50只，4周齡，體質量（150±10）g，購自天津軍事科學院，合格證號0002257。動物于中國醫學科學院生物醫學工程研究所，溫度23～25 ℃，濕度（50±5）%，適應性飼養1周。動物實驗遵循中國醫學科學院生物醫學工程研究所實驗動物管理規定，符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

甲氨蝶呤（2.5 mg/片，批號20100302）購自上海醫藥有限公司信誼制藥總廠；痹祺膠囊（國藥準字Z10910026，批號311345，規格0.3 g/粒）購自天津達仁堂京萬紅藥業有限公司；牛Ⅱ型凍干膠原、不完全弗式佐劑，購自美國Chondrex公司；COMP ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋有限公司；qRT-RCR試劑和COMP、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde- 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列均購自上海生工生物工程技術有限公司。

1.3 儀器

YLS-7B足趾容積測量儀（濟南益延科技發展有限公司）；XSP-300型雙目顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）；DG5032型酶聯免疫檢測儀（南京市華東電子團體醫療裝備有限責任公司）；CFX96型熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；恒溫離心機（江蘇省鹽城市凱特實驗儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

牛Ⅱ型凍干膠原溶于乙酸，按1∶1與不完全弗式佐劑混勻制成乳劑。隨機選取10只SD大鼠作為對照組，其余大鼠尾根部sc 0.2 mL乳劑，第2周再次注射0.1 mL乳劑，對照組注射等體積生理鹽水。第3周將造模大鼠按足腫脹程度隨機分為模型組，痹祺膠囊中、高劑量（0.6、0.9 g/kg，相當于臨床劑量的10、15倍）組，甲氨蝶呤（1.67 mg/kg，相當于臨床劑量的10倍）組，每組10只。痹祺膠囊溶于生理鹽水分別配制成質量濃度為0.06、0.09 g/mL的溶液，甲氨蝶呤溶于生理鹽水配制成質量濃度為0.167 mg/mL的溶液。痹祺膠囊組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，1次/d；甲氨蝶呤組ig相應藥物，1次/周，連續4周。用足趾容積測定儀測定大鼠后足體積，每2天1次，計算大鼠足腫脹率。

足腫脹率＝(隔日大鼠后足體積－第1天大鼠后足體積)/第1天大鼠后足體積

2.2 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響

各組大鼠脫頸椎處死，腹主動脈取血后分離血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中COMP水平。

2.3 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達的影響

取各組大鼠左側踝關節，按照SP試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書進行切片顯色后，蘇木素復染，脫水、透明、中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察滑膜COMP陽性細胞并拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性蛋白含量變化。

2.4 痹祺膠囊對RA大鼠軟骨中COMP mRNA表達的影響

取各組大鼠左側踝關節，按照Trizol試劑說明書提取大鼠軟骨總RNA，測定其質量濃度后，逆轉錄合成cDNA，進行qRT-RCR分析。引物序列：COMP上游引物為5’-GAGAACTTTGCCGTTGAA- GC-3’，下游引物為5’-GCTTCCTGTAGGTGGCAA- TC-3’；GAPDH上游引物為5’-CAGGGCTGCCTTC- TCTTGTG-3’，下游引物為5’-GATGGTGATGGGT- TTCCCGT-3’。qRT-RCR程序：94 ℃、4 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35次循環后延伸7 min。

2.5 統計分析

3 結果

3.1 痹祺膠囊對RA大鼠一般情況的影響

模型組大鼠精神萎靡、毛色晦黯、體質量增長遲緩、飲食減少、行動遲緩；各給藥組大鼠精神狀態、體質量、毛色、飲食、行走步態均較模型組有所緩解。

3.2 痹祺膠囊對RA大鼠足腫脹率的影響

如圖1所示，造模2周內，模型組大鼠足腫脹率升高，第15～23天給藥組大鼠足腫脹率降低，第24天給藥組較模型組大鼠足腫脹率降低。

3.3 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中COMP水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中COMP水平顯著降低（＜0.001）。

圖1 痹祺膠囊對RA大鼠足腫脹率的影響()

表1 痹祺膠囊對RA大鼠血清COMP水平的影響()

與對照組比較：***＜0.001；與模型組比較：###＜0.001，下表同

***< 0.001control group;###< 0.001model group, same as blow table

3.4 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達的影響

如圖2和表2所示，對照組滑膜未見COMP表達；與對照組比較，模型組滑膜可見大量陽性細胞，COMP蛋白表達顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組滑膜可見部分陽性細胞，COMP蛋白表達顯著降低（＜0.001）。

圖2 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜中COMP蛋白表達的影響(×400)

表2 痹祺膠囊對RA大鼠滑膜COMP蛋白表達的影響()

3.5 痹祺膠囊對RA大鼠軟骨中COMP mRNA表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠軟骨中COMP mRNA表達顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠軟骨中COMP mRNA表達顯著降低（＜0.001）。

與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：###P＜0.001

4 討論

RA是一種不可逆轉的自身免疫性疾病，其治療原則為抗炎、鎮痛、抑制關節破壞。目前臨床上用于治療RA的藥物多為非甾體抗炎藥、皮質類固醇、抗風濕藥、生物制劑等，具有骨丟失、肝衰竭、呼吸衰竭等不良反應[5-6]。甲氨蝶呤是RA治療的首選藥物，可選擇性作用于細胞S期，干擾細胞DNA的合成，抑制滑膜細胞增殖，發揮抗炎作用，并可阻止滑膜侵襲軟骨及骨，延緩RA的病程進展[7]。然而，長期服用甲氨蝶呤具有肝毒性、腫瘤抑制等嚴重不良反應，可致胎兒畸形[8]。因此開發一種不良反應小、便于長期服用的藥物對治療RA有重要意義。

痹祺膠囊是治療RA的常用中藥制劑，由三七、馬錢子、黨參、白術、丹參、川芎、甘草等藥物組成，全方具有散寒除濕、活血通絡的功效，經多年臨床使用證實對RA有確切療效。痹祺膠囊對CIA大鼠后足腫脹度、關節炎指數和疼痛有明顯改善作用，可抑制CIA大鼠的原發性、繼發性損害，可通過下調白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）表達，上調骨保護素表達，干預慢性滑膜炎癥、血管翳形成、軟骨及骨的破壞[9-12]。現代藥理學研究表明，馬錢子可抑制成纖維樣滑膜細胞的增殖，丹參可促進成纖維樣滑膜細胞凋亡并抑制其侵襲，從而抑制滑膜增生及血管翳的形成[13]。

COMP是RA診斷和預后的標志物。RA早期患者血清中COMP水平升高，滑膜COMP表達水平可用于觀察軟骨破壞及關節疾病預后[14]。Carlsen等[15]發現COMP誘導的關節炎模型依賴于由T細胞識別、呈遞分子的相容性復合體，而T細胞可促進炎癥因子及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）產生，破壞軟骨代謝。本研究結果顯示，模型組血清中COMP水平、滑膜中COMP表達均顯著升高，提示CIA模型成功建立。研究發現，RA患者血清中COMP水平與疾病活動評分和軟骨破壞顯著相關[16]。本研究結果顯示，模型組大鼠軟骨中COMP mRNA表達顯著升高，提示COMP可能通過誘導MMPs的產生從而破壞軟骨；各劑量痹祺膠囊組血清中COMP水平、滑膜中COMP表達和軟骨中COMP mRNA水平均顯著降低，與甲氨蝶呤療效相當。

綜上所述，痹祺膠囊可能通過下調血清中COMP水平、滑膜和軟骨中COMP表達，抑制炎性浸潤、滑膜增生和關節破壞，從而發揮保護關節軟骨的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on mechanism of Biqi Capsule in treating collagen induced arthritis rats

ZHANG Dong-mei1, LI Bao-li2

1. Affiliated Hospital of Tianjin Academy of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300120, China 2. General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

To investigate the effect of Biqi Capsule (痹祺膠囊) on the expression of cartilage oligomeric matrix protein (COMP) in CIA rats.A total of 10 rats were randomly selected as control group, the other rats were used to establish CIA model, CIA rats were randomly divided into model group, low-, medium-dose Biqi Capsule (0.6, 0.9 g/kg) groups and methotrexate (1.67 mg/kg) group. After administration for 4 weeks, the changes of paw swelling in rat were observed; The level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were tested.Compared with control group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were significantly increased in model group (< 0.001); Compared with model group, level of COMP in serum, expression of COMP in synovium and mRNA level of COMP in cartilage were decreased in treatment groups (< 0.001).Biqi Capsule may prevent inflammatory infiltration, synoviocyte proliferation, cartilage destruction by inhibiting the expression of COMP, and then treat rheumatoid arthritis.

Biqi Capsule; rheumatoid arthritis; cartilage oligomeric matrix protein; collagen-induced arthritis; synovium

R285.5

A

0253 - 2670(2021)04 - 1059 - 04

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.04.019

2020-11-10

張冬梅，醫學碩士，從事風濕免疫、內分泌的臨床與藥理學研究。E-mail: 13516268238@163.com

李寶麗，碩士研究生導師，主任醫師，從事風濕免疫方向研究。E-mail: li3106@sina.com

[責任編輯 李亞楠]