miR-125a下調Notch1參與調控心肌梗死后心肌纖維化

楊澤福，萬建平，潘 偉，薛世榮，楊 玲

心肌梗死(Myocardial Infarction，MI)是心臟冠狀動脈堵塞導致的急性心肌壞死，常伴隨心臟重構性修復后心肌纖維化(Myocardial fibrosis，MF)[1-2]。MF是MI后有助于心臟重塑的一種重要的病理過程和發病機制[3]。據統計，全球每年約有65%的MI患者表現有MF性心臟重構[4]。因而限制MI后的纖維化對預防和治療心臟病尤為重要。

在正常情況下，心臟成纖維細胞保持相對生長靜止，分泌適量的膠原蛋白等細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)以維持心臟的結構完整性和正常功能。當發生MI，心臟成纖維細胞被激活，其增殖并分化為高表達α-平滑肌肌動蛋白(α-Smooth Muscle Actin，α-SMA)的肌成纖維細胞，導致纖維化心肌中過多的I型膠原蛋白等ECM沉積，引起心臟重構。因此，抑制心臟成纖維細胞激活及分泌膠原蛋白等ECM合成是治療MI后MF的重要靶點。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNAs)是一類小型非編碼RNA，因其對基因表達的負面調控而備受關注[5]。miRNA通過互補序列與靶mRNA的3′端非翻譯區域結合導致翻譯抑制，影響細胞增殖凋亡，可以作為生物標志物應用于臨床疾病診斷和治療[4,6-7]中，肝纖維化小鼠高表達miR-125a參與調控肝星狀細胞細胞增殖和活化調控[8]。最新研究發現，miR-125a具有調控Notch信號通路參與調節細胞增殖凋亡[9-12]。且Notch信號傳導與轉化生長因子-β1/Smad3信號傳導之間存在相關作用[13]。然而miR-125a是否調控Notch1信號傳導以調節MF尚不明確。

因此，本研究旨在分析MI后MF患者臨床特點與miR-125a的關系，并研究miR-125a是否通過調控Notch1蛋白參與調控心臟成纖維細胞增殖凋亡及其活化，為miR-125a在MI后MF的干預提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年10月-2018年10月佛山市南海區人民醫院235例MI患者，其中115例為MF患者組，120例為非MF患者組，整理分析性別比例、BMI、高血壓、糖尿病等危險因子信息，同時分析患者心電圖特征，收集外周血并分離血漿后與病變組織共同凍存于-80 ℃備用。本研究經本院倫理委員會審核批準，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 切片染色分析和組織羥脯氨酸含量檢測 取患者心臟組織50 mg，依據試劑盒(武漢塞維爾生物技術有限公司)說明書，進行羥脯氨酸含量檢測。用4%多聚甲醛固定24 h，常規包埋、切片后，標準脫蠟、水化后進行Masson染色，封片并拍照。切片經檸檬酸鹽溶液修復后，5%人血清封閉1 h，孵育α-SMA(1∶250,武漢三鷹生物技術有限公司)、Ⅰ型膠原(1∶200，武漢三鷹生物技術有限公司)4 ℃ 12 h，PBST漂洗3次，CY3標記兔抗人二抗(1∶500，武漢塞維爾生物技術有限公司)室溫1 h并依據兔SP試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)操作進行免疫熒光和免疫組化實驗。采用Image-Pro Plus 6.0分析其染色面積。

1.2.2 原代心臟成纖維細胞培養 取人心臟組織100 mg，剪碎后加入1 g/L胰酶(Thermo Fisher公司,美國)和0.8 g/L膠原酶Ⅳ(Thermo Fisher公司,美國)，4 ℃消化30 min，加入10%胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司)的Dulbecco的改性Eagle營養混合物F-12培養基(Thermo Fisher公司,美國)，用100目細胞過濾篩子過濾混合液，離心收集沉淀，接種于10 mm培養皿中，37 ℃、5%CO2培養，采用α-SMA和Vimentin(武漢塞維爾生物技術有限公司)鑒定心臟成纖維細胞。

1.2.3 CCK-8比色法檢測細胞增殖 取第3代原代心臟成纖維細胞，每孔5 000個接種96孔培養板中，24 h后加入40 μmol/L的miR-125a抑制劑(廣州銳博生物科技有限公司)和lipo2000(Thermo Fisher公司,美國)混合液處理于37 ℃、5% CO2培養箱中培養0、12、24、48和72 h后，加入CCK-8溶液(武漢塞維爾生物技術有限公司)37 ℃孵育1 h，采用酶標儀(Bio-Tek，美國)測定450 nm的吸光值(OD450)。每組設3個復孔，實驗重復3次，以0 h為100%增殖率作參照計算增殖率。

1.2.4 Annexin Ⅴ/PI雙標法和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色檢測細胞凋亡 取第3代原代心臟成纖維細胞，每孔2.5×106個接種6孔培養板中，24 h后加入40 μmol/L的miR-125a抑制劑和lipo2000混合液處理24 h，使用1 μg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(武漢塞維爾生物技術有限公司)染色后利用熒光顯微鏡進行形態學觀察，通過形態學變化評價細胞凋亡。同時，以無酶消化液(武漢塞維爾生物技術有限公司)收集細胞，計數后調整細胞密度為1×106/mL，加Annexin Ⅴ-FITC(Ebioscience，美國)和PI各1 μL，4 ℃孵育30 min，離心漂洗后，以200 mL PBS重懸后，在流式細胞儀(ACEA，美國)測定早期凋亡細胞百分率。

1.2.5 Western Blot檢測蛋白的表達 取第3代原代心臟成纖維細胞，每孔2.5×105個接種24孔培養板中，24 h后加入0、20、40、60、80和100 μmol/L的miR-125a抑制劑和lipo2000混合液處理，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，12孔板接種細胞加入20 ng/mL的轉化生長因子-β1(武漢羅德生物科技有限公司)處理6 h后，轉染40 μmol/L miR-125a抑制劑24 h，收集細胞加入含磷酸化酶抑制劑(武漢塞維爾生物技術有限公司)和Cocktail的RIPA總蛋白裂解液(武漢塞維爾生物技術有限公司)60 mL，冰上裂解20 min，細胞刮收集至1.5 mL EP管，超聲破碎，10 000×g、4 ℃離心20 min,取上清液至1.5 mL EP管，以BCA試劑盒(武漢塞維爾生物技術有限公司)檢測蛋白濃度，各組取20 mg蛋白，熱變性后于10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，200 mA轉膜2 h后封閉，加入一抗(Notch1、α-SMA、CollagenⅠ和Smad2/3稀釋比為1∶1 000，p-Smad2/3稀釋比為1∶500(R&D公司，美國)；GAPDH稀釋比為1∶2 500(武漢三鷹生物技術有限公司)，4 ℃過夜，洗膜，加入HRP標記二抗(武漢塞維爾生物技術有限公司)室溫下作用1 h后ECL顯影曝光(Bio-Rad，美國)。以ImageJ分析條帶灰度值，統計分析蛋白的表達量，每組實驗重復3次。

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-125a表達 收集患者血漿和組織，按照Trizol一步提取試劑盒(武漢塞維爾生物技術有限公司)提取總RNA并使用NanoDrop2000對RNA濃度和純度進行檢測。參照第一鏈cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher公司,美國)操作步驟將300 ng總RNA逆轉錄為cDNA。取10 ng cDNA作模版，10 μL qRT-PCR反應體系,SYBGreenⅠ染料(TaKaRa，中國)檢測miR-125a水平，反應程序：95 ℃、3 min，95 ℃、5s，60 ℃、30 s，擴增35個循環。以U6為內參，采用2-△△Ct法計算miR-125a相對表達量，每個樣本復孔3個，產物用含Goldview(武漢塞維爾生物技術有限公司)的2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 MI后MF患者臨床特征分析 本研究中MI后MF患者與MI后非MF患者相比，無明顯年齡、性別、BMI和高血壓等危險因子顯著性差別，表1。

表1 兩組患者的臨床特征

2.2 MI后MF患者心臟重構和ECM檢測 MI后MF患者心臟組織羥脯氨酸、α-SMA和CollagenⅠ含量顯著高于MI后非MF患者，Masson染色顯示，其心臟組織重構明顯高于MI后非MF患者，圖1。

圖1 MI后MF的ECM特征與MI后非MF比較，*P<0.05

2.3 MI后MF患者的超聲心電圖特征分析 MI后MF患者與非MF患者相比，心率、每搏輸出量、分數縮短、心輸出量CO和心臟指數無明顯的變化，左心室收縮壓顯著升高和舒張壓顯著降低，收縮末期容積、舒張末期容積、射血分數、舒張期末室間隔厚度和左室后壁厚度顯著升高，表2。

表2 兩組患者的超聲心電圖表征

2.4 MI后MF患者miR-125a含量檢測 MI后MF患者與非MF患者相比，外周血和組織中miR-125a含量顯著升高，圖2。

圖2 miR125a在MI后MF中表達上調與MI后非MF比較，***P<0.001

2.5 miR-125a含量與心功能和纖維化相關性 MI后MF患者顯著升高的miR-125a含量與左心室收縮壓、收縮末期容積、舒張末期容積、射血分數顯著正相關，與左心室舒張壓呈顯著負相關。與心臟組織HYP、α-SMA和CollagenⅠ含量呈顯著正相關，表3。

表3 miR-125a與心功能和纖維化相關分析

2.6 miR-125a對原代心肌成纖維細胞Notch1蛋白表達的影響 40、60、80、100 μmol/L的miR-125a抑制劑組miR-125a表達量明顯低于0濃度的miR-125a抑制劑組，Notch1蛋白表達量明顯高于0濃度的miR-125a抑制劑組，同時具有劑量依賴性，圖3。

圖3 miR-125a抑制劑下調心肌成纖維細胞miR-125a和上調Notch1蛋白表達與0 濃度組比較，*P<0.05

2.7 miR-125抑制劑對原代心肌成纖維細胞增殖和凋亡影響 40 μmol/L的miR-125a抑制劑處理組細胞增殖率在24、48和72 h明顯低于40 μmol/LmiR-NC組(對照組)，且具有時間依賴性。在24 h，其細胞核固縮和Annexin Ⅴ+PI-細胞比例明顯高于對照組水平，圖4。

圖4 miR-125a抑制劑抑制心肌成纖維細胞增殖和促進其凋亡與對照組比較，*P<0.05，***P<0.001

2.8 miR-125抑制劑對轉化生長因子-βb1激活的原代心肌成纖維細胞Notch1、p-Smad2/3、α-SMA和CollagenⅠ蛋白影響 轉化生長因子-β1和40 μmol/L的miR-125a抑制劑聯合處理組的Notch1明顯高于轉化生長因子-βb1和40 μmol/L的miR-NC聯合處理對照組，p-Smad2/3、α-SMA和CollagenⅠ蛋白含量明顯低于轉化生長因子-β1和40 μmol/L的miR-NC聯合處理對照組，圖5。

圖5 miR-125a抑制劑抑制轉化生長因子-β1激活的心臟成纖維細胞中的Notch1，p-Smad2/3，α-SMA和Collagen Ⅰ表達與對照組比較，*P<0.05

3 討論

MI后MF是心臟功能障礙和死亡的主要原因[14]。心臟成纖維細胞增殖激活是MF發生發展的關鍵過程[15-16]。明確心臟成纖維細胞增殖和激活的機制將為MF相關心臟病變的預防和治療提供重要線索。

miRNAs在多種類型疾病中發揮著預防、調控與預測病程的作用[5]。本研究中，首先通過對MI后非MF和MF患者血漿以及組織中miR-125a表達分析發現，MF患者高表達miR-125a，提示其可能參與MF的發生發展。這與文獻中報道miR-125a調控纖維化病變相符[8]。其次，本研究分析了其與心電圖特征和ECM含量關系，證實其顯著相關，從而證明其可能作為MF的治療和監測生物標志物，是否真的對病程有一定的指示仍有待進一步證實。Notch信號和轉化生長因子-β1/Smad3信號傳導可誘導心臟成纖維細胞增殖激活并介導MF[13]。然而，miR-125a是否調控二者尚不明確。早期研究表明，轉化生長因子-β1誘導的新生大鼠心臟CMT中Notch1表達下調[17]。此外，成年小鼠的應激心臟中的Notch活化抑制轉化生長因子-β1誘導CMT和MF。為了闡明miR-125a是否調節Notch1和轉化生長因-β1/Smad3信號傳導參與MF形成[18]。本研究檢測了miR-125a抑制劑對人原代心臟成纖維細胞增殖凋亡和活化的影響，結果顯示，miR-125a抑制劑具有時間依賴性，抑制人原代心臟成纖維細胞增殖的作用，且可促進凋亡。同時具有阻斷轉化生長因子-β1激活的心臟成纖維細胞分泌膠原等ECM的作用。因此，miR-125a參與調控人原代心臟成纖維細胞增殖、凋亡及其活化和分泌ECM。

總之，使用MI后MF患者血液和組織及轉化生長因子-β1誘導的人原代心臟成纖維細胞激活模型，本研究證明miR-125a通過調控Notch1信號參與心臟成纖維細胞激活和增殖凋亡。miR-125a是否具有調控其他信號蛋白及Notch信號及其下游信號分子如何參與MF仍需要進一步研究。