LAMA3在胰腺癌中的表達及其臨床意義

李晨，宋洪亮，俞海波，單云峰

（1.溫州醫科大學定理臨床學院 肝膽胰外科，2.溫州醫科大學附屬第一醫院 肝膽外科，浙江 溫州 325000）

胰腺癌是具有較高病死率的消化道惡性腫瘤之一，并在未來的20～30年有可能成為惡性腫瘤患者中第二大死因[1-2]。在美國，目前胰腺癌的5年生存率約為10%，而在不發達國家其5年生存率低于5%。80%～85%的患者被發現時已屬晚期，腫瘤難以切除[3]，部分可以切除的患者中其5年生存率不到20%[4]。雖然近幾年生物技術不斷發展，圍手術期管理不斷進步，放化療研究不斷深入，但是胰腺癌仍缺少特異性強、敏感性高的診斷標志物以及有效的治療手段。層粘連蛋白3（LAMA3）的編碼基因位于18號染色體上，有76 個外顯子，包括短鏈LAMA3 A轉錄本和長鏈LAMA3 B轉錄本，其轉錄本由39 至76 位外顯子轉錄剪接而成。LAMA3目前已被證實廣泛參與腫瘤的侵襲轉移[5-7]。大量的文獻已經報道LAMA3在胃癌[8]、卵巢癌[9]、肝癌[10]、膀胱癌[11]等腫瘤中表達異常，其在腫瘤中表達異常可能與其參與DNA甲基化以及組蛋白的去乙酰化相關。LAMA3在胰腺癌的研究鮮有報道，本課題擬分析LAMA3在胰腺癌患者中的表達情況并分析其與臨床病理特征及腫瘤預后的相關性，以期判斷其是否可以作為胰腺癌預后的分子標志物。

1 資料和方法

1.1 一般資料

回顧性分析2011年5月至2018年12月溫州醫科大學定理臨床學院收住的胰腺癌患者40例，術后病理均確診為胰腺導管腺癌，均行手術治療，其中胰十二指腸切除術28例，胰腺體尾部12例，術前未進行輔助化療。其中男17例，女23例，年齡56～74歲，平均65.2 歲，伴有淋巴結轉移19 例。根據最新的AJCC胰腺癌TMN分期，I～II期15例，III～IV期25例。本研究方案經溫州醫科大學定理臨床學院/溫州市中心醫院機構倫理委員會批準。

1.2 主要試劑

重組人抗LAMA3抗體[EPR8266]（ab151715），購自美國Abcam。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化評估LAMA3的表達情況：將胰腺癌組織及癌旁組織標本固定在10%中性福爾馬林緩沖液中，并用石蠟包埋。切割，脫蠟并重新水化后，對5 μm切片進行抗原修復。組織切片與抗LAMA3的一抗（1:100稀釋）在4 ℃孵育過夜。使用Image-Pro plus（IPP）6.0軟件，通過染色強度和陽性染色細胞的百分比評估LAMA3的表達。根據IPP評分將染色強度分為四個等級：0（癌細胞無染色），1（弱染色），2（中度染色），3（強度染色）。陽性細胞的百分比評分如下：0（0），1（1%～25%），2（26%～50%），3（＞50%）。染色總分=陽性細胞的百分比評分×強度得分。總分0～2定義為低表達，3～9分為高表達。

1.3.2 實時定量PCR（qRT-PCR）檢測LAMA3 的mRNA水平：采用Trizol試劑，將總RNA（0.5 μg）反轉為cDNA，用SYBR Green PCR測定LAMA3的mRNA水平，所有檢測均重復三次。LAMA3 的相對表達分別相對于內參GAPDH進行了標準化。使用2-ΔΔCt法分析數據。GAPDH正向引物：5’-ATGGGGAAGGT GAAGGTCG-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGG CAACAATA-3’；LAMA3正向引物：5’-GTTTCACTG ATTTGGGCTTACC-3’，反向引物：5’-AGTCCAGAG TTGTCGCTTATTACA-3’。

1.3.3 Western blotting檢測LAMA3蛋白水平：將胰腺癌組織和癌旁組織在含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解緩沖液中于冰中裂解1 h，使用BCA蛋白測定對樣品蛋白進行定量。通過SDS-PAGE分離等量的蛋白質，轉移到PVDF膜上，并用抗體進行檢測。一抗LAMA3和GAPDH的濃度為1:1 000，相應的二抗的濃度為1:2 000。

1.3.4 LAMA3 生物信息學分析：癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）及Oncomine數據庫（https://www.oncomine.org/resource/login.html）被用于驗證LAMA3在胰腺癌組織中的表達情況。TCGA數據庫總共包括87 個胰腺癌組織樣本及80個正常組織樣品。

1.4 統計學分析

使用統計軟件包SPSS 19.00進行統計分析。率的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier方法，并進行對數秩（Log-rank）檢驗進行比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織及癌旁組織中LAMA3的表達情況

免疫組織化學染色顯示，在40對胰腺癌和癌旁組織中，24例癌組織LAMA3高表達（24/40，60%），而在癌旁組織中僅有10例LAMA3呈高表達（10/40，25%），兩組高表達率對比有統計學差異（P＜0.05），見圖1。同時我們從40 例胰腺癌患者中隨機選擇了15組配對的胰腺癌組織和癌旁組織進行qRT-PCR檢測，并隨機從其中選擇6組配對的胰腺癌組織和癌旁正常組織中進行蛋白質印跡分析。qRT-PCR和蛋白質印跡結果顯示了癌組織中LAMA3 表達水平顯著上調（圖2A和2B）。

圖1 胰腺癌組織及癌旁組織LAMA3陽性表達情況，陽性反應表現為棕色顆粒（免疫組化，×100）。

圖2 胰腺癌組織及癌旁組織LAMA3 qRT-PCR和Western blotting檢測結果

2.2 胰腺癌組織中LAMA3表達與臨床病理特征的關系

分析表明胰腺癌組織中LAMA3的表達與患者的腫瘤大小、TNM分期有關（P＜0.05），腫瘤大于2 cm以及TNM分期III～IV期的患者其表達水平更高。LAMA3 的表達與患者的性別、年齡、CA199 水平、分化程度、淋巴轉移等無明顯相關（P＞0.05）。見表1。

2.3 LAMA3高表達組和低表達組胰腺癌患者的生存曲線

LAMA3 高表達組和低表達組胰腺癌患者的生存曲線如圖3 所示。LAMA3 高表達的患者預后較LAMA3低表達更差（P＜0.001）。

2.4 LAMA3在GEO及Oncomine數據庫中的表達情況

對GEO及Oncomine數據庫進行分析，LAMA3在GSE16515（P＜0.0001）、GSE15471（P＜0.0001）、GSE3654（P＜0.0001）中的表達明顯升高，其結果見圖4。

表1 LAMA3表達情況與患者臨床病理特征的關系（例）

圖3 LAMA3高表達組和低表達組胰腺癌患者的生存曲線

圖4 GEO及Oncomine數據庫分析提示胰腺癌患者LAMA3表達明顯升高（P＜0.0001）。

3 討論

層粘連蛋白是由α、β和γ亞基組成的異三聚體分子，它們通過卷曲螺旋結構域組裝。層粘連蛋白對于基底膜的形成和功能至關重要，并在調節細胞遷移和信號轉導方面具有比較重要的功能[12]。而LAMA3基因則主要編碼層粘連蛋白α亞單位，其變異會影響層粘連蛋白的表達，進而影響層粘連蛋白的生物活性。LAMA3蛋白在腫瘤發生發展中具有重要的作用。研究表明，在卵巢癌中LAMA3的表達水平低于正常組織和癌旁組織，LAMA3高表達組無復發生存率和總生存率明顯高于LAMA3低表達組[9]。一項關于cDNA芯片研究與HCV感染相關的肝癌患者中，LAMA3表達顯著上調[10]。LAMA3在腫瘤中的作用機制可能與DNA甲基化以及被miRNA調控有關。研究發現，胃癌組織中LAMA3甲基化水平顯著升高，提示LAMA通過DNA的甲基化參與了癌細胞的發展[13]。另有研究表明miRNA-17/20a通過靶向LAMA3參與口腔癌的侵襲轉移[14]。

課題組前期通過文獻檢索及生物信息學篩選，發現LAMA3在胰腺癌中存在差異表達，可能與胰腺癌的發生發展相關。為了進一步明確LAMA3在胰腺癌中的表達及其與臨床病理特征的關系，我們對40例胰腺癌組織標本進行了免疫組化檢測，同時對部分組織進行了Western blotting檢測以及qPCR檢測，發現LAMA3蛋白和mRNA在胰腺癌組織中呈現明顯的高表達，三者結果相符，以上結果證實了LAMA3在胰腺癌的發展發展中可能扮演著癌基因的角色。通過統計分析，結果證實了LAMA3表達水平與患者的腫瘤大小、TNM分期明顯相關，而與患者的性別、年齡、CA199水平、分化程度、淋巴轉移等無關，腫瘤大于2 cm以及TNM分期III～IV期的患者其表達水平更高。本研究結果提示LAMA3 可能成為判斷胰腺癌患者預后的腫瘤標志物。為進一步了解LAMA3表達與患者預后相關性，我們進行了生存曲線分析，該結果驗證了我們的假設，LAMA3低表達的胰腺癌患者具有更長的生存時間。

本研究結果提示LAMA3 可能在胰腺癌的發生發展中起重要作用，但是由于我們的研究樣本量小，為了進一步驗證我們的結果，我們進行了在線生物信息分析，從臨床樣本庫的生信分析中，發現其結果與我們的研究相符，臨床樣本庫的結果同樣提示在胰腺癌患者中LAMA3的表達水平明顯升高。

綜上所述，在胰腺癌中LAMA3高表達，提示預后不良，其可能成為判斷胰腺癌患者預后的腫瘤標志物，并且可能成為胰腺癌患者靶向治療的潛在靶點，但其在胰腺癌中發揮作用的機制有待于進一步研究。